Western的原理

  幾乎所有蛋白質(zhì)電泳分析都在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行，而所用條件總要確保蛋白質(zhì)解離成單個(gè)多肽亞基并盡可能減少其相互間的聚集。最常用的方法是將強(qiáng)陰離子去污 劑SDS與某一還原劑并用，并通過(guò)加熱使蛋白質(zhì)解離后再加樣于電泳凝膠上。變性的多肽與SDS結(jié)合并因此而帶負(fù)電荷，由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多 肽的分子量成正比而與其序列無(wú)關(guān)，因此SDS多肽復(fù)合物在聚丙烯酰凝膠電泳中的遷移只與多肽的大小相關(guān)。在達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克多肽約可結(jié)合1.4克去 污劑，借助已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)參照物，則可測(cè)算出多肽鏈的分子量。

SDS聚 丙烯酰胺凝膠電泳大多在不連續(xù)緩沖系統(tǒng)中進(jìn)行，其電泳槽緩沖液的pH值與離子強(qiáng)度不同于配膠緩沖液，當(dāng)兩電極間接通電流后，凝膠中形成移動(dòng)界面，并帶動(dòng)加 入凝膠的樣品中所含的SDS多肽復(fù)合物向前推進(jìn)。樣品通過(guò)高度多孔性的積層膠后，復(fù)合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區(qū)帶（或稱(chēng)積層）。曲于不連續(xù)緩沖系 統(tǒng)具有把樣品中的復(fù)合物全部濃縮于極小體積的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝膠的分辨率。

樣品和積層膠中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽緩沖液含Tris^-甘 氨酸(pH8.3)，分離膠中含Tris-Cl(pH8.8)的。系統(tǒng)中所有組分都含有0.1%的SDS(Laemmli,1970)，樣品和積層膠中的 氯離干形成移動(dòng)界面的先導(dǎo)邊界而甘氨酸分子則組成尾隨邊界，在移動(dòng)界面的兩邊界之間是一電導(dǎo)較低而電位滴度較陡的區(qū)域，它推動(dòng)樣品中的多肽前移并在分離膠 前沿積聚，此處pH值較高，有利于甘氨酸的離子化，所形成的甘氨酸離子穿過(guò)堆集的多肽并緊隨氯離子之后，沿分離膠泳動(dòng)。從移動(dòng)界面中解脫后，SDS多肽復(fù) 合物成一電位和pH值均勻的區(qū)帶泳動(dòng)穿過(guò)分離膠，并被篩分而依各自的大小得到分離。

電泳 丙烯酰胺凝膠電泳通常用來(lái)查看蛋白混合物樣品的復(fù)雜程度和監(jiān)測(cè)純化效果。這種方法分離效果極好，可惜很難在不喪失精度情況下放大到制備規(guī)模，因?yàn)殡S著膠厚度的增加，電泳時(shí)的熱效應(yīng)會(huì)嚴(yán)重干擾蛋白的泳動(dòng)。

Western bloting首 先是要將電泳后分離的蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)移到NC膜上，通常有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法。毛細(xì)管印跡法是將凝膠放在緩沖液浸濕的濾紙上，在凝膠上放 一片NC膜，再在上面放一層濾紙等吸水物質(zhì)并用重物壓好，緩沖液就會(huì)通過(guò)毛細(xì)作用流過(guò)凝膠。緩沖液通過(guò)凝膠時(shí)會(huì)將蛋白質(zhì)帶到NC膜上，NC膜可以與蛋白 質(zhì)通過(guò)疏水作用產(chǎn)生不可逆的結(jié)合。但是這種方法轉(zhuǎn)移效率低，通常只能轉(zhuǎn)移凝膠中的一小部分蛋白質(zhì)（10%-20%）。而電泳印跡可以更快速有效的進(jìn)行轉(zhuǎn) 移。這種方法是用有孔的塑料和有機(jī)玻璃板將凝膠和NC膜夾成“三明治”形狀，而后浸入兩個(gè)平行電極中間的緩沖液中進(jìn)行電泳，選擇適當(dāng)?shù)碾娪痉较蚓涂梢允沟?白質(zhì)在電場(chǎng)力的作用下離開(kāi)凝膠結(jié)合到NC膜上。常用的電泳轉(zhuǎn)移方法有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場(chǎng)的機(jī)械裝置不 同。濕轉(zhuǎn)是一種傳統(tǒng)方法，將膠/膜疊層浸入緩沖液槽然后加電壓。這是一種有效方法但比較慢，需要大體積緩沖液且只能用一種緩沖液。半干轉(zhuǎn)移，用浸透緩沖液 的多層濾紙代替緩沖液槽。與濕轉(zhuǎn)相比，這種方法要快（15-45 分鐘）。
轉(zhuǎn)移后的NC膜就稱(chēng)為一個(gè)印跡（blot）,用于對(duì)蛋白質(zhì)的進(jìn)一步檢測(cè)。印跡首先用蛋白溶液（如10%的BSA或脫脂奶粉溶液）處理以封閉NC膜上剩余的疏水結(jié)合位點(diǎn)，而后用所要研究的蛋白質(zhì)的抗體（一抗）處理，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)與一抗特異結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，而其它的蛋白質(zhì)不能與一抗結(jié)合，這樣清洗除去未結(jié)合的一抗后，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)的位置上結(jié)合著一抗。處理過(guò)的印跡進(jìn)一步用適當(dāng)標(biāo)記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠中獲得的，則二抗就是抗鼠IgG的抗體。處理后，帶有標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合形成抗體復(fù)合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質(zhì)的位置。目前有結(jié)合各種標(biāo)記物的抗體特定IgG的抗體（二抗）可以直接購(gòu)買(mǎi)，最常用的一種是酶連的二抗，印跡用酶連二抗處理后，再用適當(dāng)?shù)牡孜锶芤禾幚?，?dāng)酶催化底物生成有顏色的產(chǎn)物時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生可見(jiàn)的區(qū)帶，指示所要研究的蛋白質(zhì)位置。在酶連抗體中使用的酶通常是堿性磷酸酶（AP）或辣根過(guò)氧化物酶（HRP）。堿 性磷酸酶可以將無(wú)色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸鹽（BCIP）轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物；而辣根過(guò)氧化物酶可以將H2O2為底物，將3-氨基-9-乙基咔唑氧化 成褐色產(chǎn)物或?qū)?-氯萘酚氧化成藍(lán)色產(chǎn)物。另一種檢測(cè)辣根過(guò)氧化物酶的方法是用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法，辣根過(guò)氧化物酶在H2O2存在下，氧化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)魯米諾 并發(fā)光，通過(guò)將印跡放在照相底片上感光就可以檢測(cè)出辣根過(guò)氧化物酶的存在，即目標(biāo)蛋白質(zhì)的存在了。除了使用抗體或蛋白作為檢測(cè)特定蛋白的探針以外，有時(shí)也 使用其它探針如放射性標(biāo)記的DNA，可以檢測(cè)印跡中的DNA結(jié)合蛋白。
在Western bloting實(shí)驗(yàn)中，有另一種方法，就是直接標(biāo)記一抗，再用底物顯色。這種方法叫直接法，與用二抗的間接法相比有諸多不足，標(biāo)記二抗可用于很多種不同特 異性的一抗，避免了標(biāo)記很多一抗的需要，同時(shí)因?yàn)橐豢菇Y(jié)合不止一個(gè)二抗分子，所以二抗可以增強(qiáng)信號(hào)。所以一般情況下都釆用間接法進(jìn)行檢測(cè)。

Western bloting要注意的一些問(wèn)題
1、為了讓實(shí)驗(yàn)更加嚴(yán)謹(jǐn)有說(shuō)服力都要設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，對(duì)照分為：陽(yáng)性對(duì)照（最好有標(biāo)準(zhǔn)品（比如β-actin，GAPDH）或陽(yáng)性血清）；陰性對(duì)照（測(cè)血時(shí)用相應(yīng)小鼠未免疫血清（即正常血）；空白對(duì)照（不加一抗，用PBS代替）；無(wú)關(guān)對(duì)照（用無(wú)關(guān)抗體）

2、一抗、二抗的濃度一般要參照抗體說(shuō)明書(shū)選擇最適當(dāng)?shù)谋壤豢苟沟倪x擇直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及背景

3、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)所釆用的抗原批次要一樣，盡量的避免人為的帶來(lái)個(gè)體差異。特別在做裂解液時(shí)更要注意所釆用的操作條件，盡可能的排除可變因素給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)不確定性。

4、凝膠的質(zhì)量直接影響以后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，要特別注意幾點(diǎn)：凝膠要均一沒(méi)有氣泡；積層膠與分離膠界面要水平；AP和TEMED的量不能過(guò)多，太多會(huì)導(dǎo)致膠易脆裂；拔梳子時(shí)要快，盡量保證點(diǎn)樣孔平整。

5、電泳、轉(zhuǎn)膜時(shí)特別要注意正負(fù)極，電壓電流都不能過(guò)高；轉(zhuǎn)膜時(shí)“三明治”的疊放次序不錯(cuò)，同時(shí)要防止產(chǎn)生氣泡；盡量讓電轉(zhuǎn)溫度保持在10度以下，冰浴為宜。
6、封閉時(shí)一般在室溫下2h就夠了，但是要注意如果是生物素標(biāo)記的二抗就不宜用牛奶，因?yàn)榕Ｄ讨泻猩锼?，用BSA效果更好。

7、加一抗二抗要嚴(yán)格保證反應(yīng)時(shí)間，洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低背景；

容易忽視的問(wèn)題主要在于過(guò)硫酸銨（AP）一定要新鮮——最好用小指管配AP（寫(xiě)日期）保存在-20度，超過(guò)2周的AP扔掉算了，或者已經(jīng)反復(fù)打開(kāi)使用多次的AP都別用

上樣電泳： 上樣前蛋白樣品最好離心，上樣量不宜過(guò)多，以免看結(jié)果時(shí)，每個(gè)條帶都彎彎地“笑”你貪多嚼不爛哦。其他的操作，按照說(shuō)明控制電流，不要過(guò)多重復(fù)使用電泳 Buffer（別小氣，重復(fù)使用會(huì)降低緩沖能力的）。當(dāng)預(yù)染的Marker告訴你，你要分辨的蛋白已經(jīng)到達(dá)最佳分辨區(qū)——分離膠的2/3處，OK，電泳結(jié) 束了。

電泳結(jié)果檢查：如果要做Western Blot，是否需要先檢查電泳結(jié)果呢？能先看看結(jié)果如何再進(jìn)行下一步轉(zhuǎn)膜當(dāng)然最好?？捡R斯亮藍(lán)使用簡(jiǎn)便快速，可以分辨1ug左右的條帶，是最經(jīng)濟(jì)通用的蛋 白PAGE膠電泳染色方法。可是由于考馬斯亮藍(lán)染色或者銀染經(jīng)過(guò)固定不可逆結(jié)合，會(huì)干擾后面的Western Blot實(shí)驗(yàn)，很多人會(huì)選擇省略掉這一步——同樣的樣品跑2塊膠，一塊染色一塊轉(zhuǎn)膜，一般也可以說(shuō)明問(wèn)題。所以最經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的方法是：麗春紅S，直接染色轉(zhuǎn) 移膜，檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效果，充分脫色后不干擾Western結(jié)果。麗春紅的檢測(cè)靈敏度和考馬斯亮藍(lán)差不多。

轉(zhuǎn)膜：經(jīng)過(guò)PAGE電泳分離后的蛋白質(zhì)樣品需要經(jīng)過(guò)“轉(zhuǎn)膜”步驟——從PAGE膠轉(zhuǎn)移到膜上固定，才能用各種方法進(jìn)行Western Blot的檢測(cè)和顯色，而且為了防止沒(méi)有電場(chǎng)的情況下已經(jīng)分離的蛋白條帶擴(kuò)散，轉(zhuǎn)移要盡快進(jìn)行轉(zhuǎn)膜的首要是選膜。

Western Blot印跡常用的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素膜（NitrocelluloseBlotting Membranes，NC）和PVDF膜，此外也有用尼龍膜、DEAE纖維素膜做蛋白印跡。選擇的根據(jù)主要有：a.膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力（也就是單 位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大?。籦.不影響后續(xù)的顯色檢測(cè)（也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好）；c.如果 后繼實(shí)驗(yàn)有其他要求，比如要做蛋白測(cè)序或者質(zhì)譜分析，還要根據(jù)不同目的來(lái)挑選不同的轉(zhuǎn)移膜。