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（1-6章）

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（7-12章）

細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查是細(xì)菌檢驗技術(shù)中最常用的方法之一，利用顯微鏡對細(xì)菌的大小、形態(tài)、排列、結(jié)構(gòu)和染色性等特點進行觀察分析，可對細(xì)菌進行初步識別和分類，為進一步做培養(yǎng)和鑒定提供依據(jù)。

一、不染色標(biāo)本：

細(xì)菌不經(jīng)染色直接鏡檢，主要觀察活菌的動力和運動情況。

懸滴法或壓滴法觀察活菌運動。

二、染色標(biāo)本：

(一)、染色標(biāo)本檢查的一般程序：涂片 → 干燥 → 固定 →染色：(初染 → 媒染 → 脫色 →復(fù)染)

三、常用染料

1、堿性染料：常用的染料有堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫、亞甲藍(lán)等。

2、酸性染料：常用的酸性染料有伊紅、剛果紅等。

3、復(fù)合染料：如瑞氏染料(伊紅亞甲藍(lán))、吉姆薩染料(伊紅天青)等。

四、常用的染色方法

革蘭染色法(Gram`s stain)：本法是細(xì)菌學(xué)中最經(jīng)典，最常用的染色方法。

1、染液：染液、碘液(盧戈碘液)、95%酒精、或沙黃。

2、 步驟：制片：涂片 → 干燥 → 固定→染色

3、染色：初染(結(jié)晶紫1min) → 媒染(碘液 1min)→ 脫色 (95%酒精30s)→ 復(fù)染(稀釋石炭酸復(fù)紅30s)

4、原理：細(xì)胞壁學(xué)說，等電點學(xué)說，核糖核酸鎂鹽學(xué)說。

5、結(jié)果：紫色 → G 菌; 紅色 → G-菌。

6、意義：鑒定細(xì)菌;選擇藥物;了解細(xì)菌的致病性。

7、影響因素

①操作因素：影響革蘭染色的關(guān)鍵步驟是脫色，②染液因素：染液放置過久可能會因水分蒸發(fā)、化學(xué)沉淀等原因而降低濃度。③細(xì)菌因素：不同時期的細(xì)菌標(biāo)本或培養(yǎng)物，染色結(jié)果會有所差異。一般細(xì)菌染色應(yīng)選用新鮮標(biāo)本或培養(yǎng)18-24的細(xì)菌培養(yǎng)物。

抗酸染色法：分枝桿菌的細(xì)胞壁內(nèi)含大量脂質(zhì)(主要是分枝菌酸)，一般不易著色，要經(jīng)過加熱和延長染色時間來促使其著色，可一旦著色，又能抵抗酸酒精脫色，故名抗酸染色。

1、染液：5%石炭酸復(fù)紅、3擦邊球0鹽酸酒精、呂氏亞甲藍(lán)液。

2、染色方法：將固定好的標(biāo)本片滴加5%石炭酸復(fù)紅并加熱至冒蒸汽初染5min，冷卻后用細(xì)流水沖洗，再用3%鹽酸酒精脫色直至菌膜無紅色脫出為止，大約30，用細(xì)流水沖洗，最后用呂氏亞甲藍(lán)復(fù)染，用細(xì)流水沖洗，干燥后鏡檢。

3、結(jié)果：紅色為抗酸菌，藍(lán)色為非抗酸菌，背景也為藍(lán)色。

其它特殊染色：莢膜染色，芽胞染色，鞭毛染色。

培養(yǎng)基：培養(yǎng)基是指用人工方法配制的適合于細(xì)菌生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。

（一）培養(yǎng)基的成分和作用

1.營養(yǎng)物質(zhì)

(1)肉浸液 肉浸液可為細(xì)菌提供氮源和碳源。

(2)牛肉膏 營養(yǎng)價值低于肉浸液，但因無糖可用作腸道桿菌鑒別培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分。

(3)蛋白胨：蛋白胨是制備培養(yǎng)基時最常用的成分之一，主要提供細(xì)菌生長繁殖的氮源。

(4)無機鹽類：其中最常用的有氯化鈉和磷酸鹽。

(5)糖類與醇類：為細(xì)菌生長提供碳源和能源。

(6)血液既含有營養(yǎng)物質(zhì)，又能提供生長因子，所以用于培養(yǎng)營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌。另外，還可根據(jù)細(xì)菌在血液培養(yǎng)基中的溶血現(xiàn)象而進行鑒定。

(7)雞蛋和動物血清　僅用于制備一些特殊的培養(yǎng)基。如培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌的雞蛋培養(yǎng)基和培養(yǎng)白喉桿菌的呂氏血清培養(yǎng)基等。

(8)生長因子　常在培養(yǎng)基中加入維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等生長因子。

2.水

水是細(xì)菌代謝過程中最重要的物質(zhì)，菌體所需要的營養(yǎng)物質(zhì)都是溶解于水中被吸收的。

3.凝固物質(zhì)

制備固體培養(yǎng)基時，需要在液體培養(yǎng)基中加入凝固物質(zhì)。最常用的凝固物質(zhì)為瓊脂。

4.指示劑

常用的有酚紅(酚磺酞)、中性紅、甲基紅、溴甲酚紫、堿性伊紅、溴麝香草酚藍(lán)和中國藍(lán)等酸堿指示劑。美蘭和刃天青常用作氧化還原指示劑。

5.抑制劑

在培養(yǎng)基中加入一定種類的抑制劑，目的在于抑制非檢出菌(非病原菌)的生長，以利于檢出菌(病原菌)的生長。常用的有膽鹽、煌綠、亞硫酸鈉、玫瑰紅酸、亞硒酸鈉、亞碲酸鹽、四硫磺酸鹽、疊氮鈉及一些染料和某些抗生素等。

(二)培養(yǎng)基的種類

1、按營養(yǎng)組成分：

(1).基礎(chǔ)培養(yǎng)基：肉湯。含牛肉浸液和蛋白胨。廣泛用于細(xì)菌的增菌、檢驗，也是制備其他培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分。

(2).營養(yǎng)培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入特殊成分，供營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌和需要特殊生長因子的細(xì)菌生長。如血瓊脂平板、巧克力血平板。

(3).鑒別培養(yǎng)基：觀察細(xì)菌生長過程中分解底物所釋放的不同產(chǎn)物通過指示劑顯示來鑒別細(xì)菌。如糖發(fā)酵管、克氏雙糖鐵瓊脂(KIA)、伊紅-亞甲藍(lán)瓊脂和動力-吲哚-尿素(MIU)培養(yǎng)基等。

(4).選擇培養(yǎng)基：加入抑制劑抑制標(biāo)本中雜菌生長，有助于所選擇的細(xì)菌種類生長(SS瓊脂)。

(5).特殊培養(yǎng)基：厭氧培養(yǎng)基和細(xì)菌L型培養(yǎng)基(皰肉培養(yǎng)基、巰基乙醇酸鈉培養(yǎng)基、高滲培養(yǎng)基)等。

2、按物理狀態(tài)分：

液體(增菌);半固體(觀察動力);固體平板(分離單菌落);固體斜面(保存菌種)。

(三)培養(yǎng)基的制備

(四)培養(yǎng)基制備的一般程序：

配料→溶化→矯正PH→過濾→分裝→滅菌→檢定→保存。

分離培養(yǎng)基的選擇

根據(jù)標(biāo)本來源、培養(yǎng)目的、可能存在的病原菌。

1.營養(yǎng)肉湯：標(biāo)本及各類細(xì)菌的增菌培養(yǎng)。

2.血平板：各類細(xì)菌檢驗標(biāo)本的分離。

3.巧克力血平板：疑有嗜血桿菌、奈瑟菌等的標(biāo)本。

4.中國藍(lán)平板或伊紅亞甲藍(lán)平板：篩選革蘭陰性細(xì)菌;鑒別發(fā)酵型革蘭陰性桿菌菌種。

5.麥康凱平板：篩選革蘭陰性桿菌和非發(fā)酵菌。

6.SS瓊脂：篩選腸道致病菌，如志賀菌和沙門菌。

7.堿性瓊脂或TCBS瓊脂：從糞便中分離霍亂弧菌及其他弧菌。

8.血液增菌培養(yǎng)基：用于從血液、骨髓中分離常見病原菌。

一、基本條件

(一)細(xì)菌實驗室：生物安全柜。

(二)無菌實驗室

(三)基本設(shè)備和器具：溫箱、CO2培養(yǎng)箱、厭氧培養(yǎng)設(shè)備;顯微鏡;高壓蒸汽滅菌器、干烤箱;接種環(huán)和接種針;火焰燈或酒精燈;平皿、試管、吸管等玻璃器皿，以及離心機、天平等。

二、常用的接種方法

(一)平板劃線接種法 用于細(xì)菌的分離培養(yǎng)。將標(biāo)本劃線接種到固體培養(yǎng)基表面，由于劃線的作用使細(xì)菌分散開，培養(yǎng)后單個：繁殖成肉眼可見的細(xì)菌集團，稱為菌落。

1、分區(qū)劃線法：此法用于含菌量多的標(biāo)本的分離培養(yǎng)。

2.連續(xù)劃線法：此法用于含菌量少的標(biāo)本的分離培養(yǎng)。

(二)、斜面接種法主要用于純培養(yǎng)、保存菌種或生化反應(yīng)所用的斜面培養(yǎng)基的接種

(三)穿刺接種法主要月主要用于觀察動力的半固體培養(yǎng)基或生化反應(yīng)所用的高層斜面培養(yǎng)基(雙糖鐵培養(yǎng)基)。

(四)液體接種法多用于增菌培養(yǎng)基(肉湯)或生化反應(yīng)所用的液體培養(yǎng)基的接種。

(五)傾注平板法用于尿液、牛乳和飲水等標(biāo)本細(xì)菌計數(shù)。將標(biāo)本適當(dāng)稀釋后，取一定量加入已滅菌的平皿內(nèi)，再傾入已溶化并冷卻至45℃左右的定量培養(yǎng)基，混勻，待凝固后倒置、培養(yǎng)。

(六)涂布接種法多用于藥敏試驗。也可用于被檢標(biāo)本中的細(xì)菌計數(shù)。

細(xì)菌的培養(yǎng)方法

根據(jù)培養(yǎng)細(xì)菌的目的和細(xì)菌類型選擇合適的培養(yǎng)方法。培養(yǎng)方法分為一般培養(yǎng)法、二氧化碳培養(yǎng)法和厭氧培養(yǎng)法等三種。

三、細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：

(一)液體培養(yǎng)基：均勻渾濁;菌膜;絮狀沉淀。

(二)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上的生長現(xiàn)象

1.菌落 細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)，由單個細(xì)菌繁殖形成的肉眼可見的細(xì)菌集團稱為菌落。

2、菌落的特性包括大小、形狀、顏色、氣味、透明度、光滑度、濕潤度、黏度、邊緣和溶血性等。

根據(jù)表面光滑度的不同，細(xì)菌的菌落大體分為三型：

⑴光滑型菌落(S型菌落)新分離的細(xì)菌大多為光滑型菌落。

⑵粗糙型菌落(R型菌落)如結(jié)核分枝桿菌和炭疽芽胞。

⑶黏液型菌落(M型菌落)如肺炎克雷伯菌。

細(xì)菌在血瓊脂平板上生長可出現(xiàn)不同的溶血現(xiàn)象。

α溶血：菌落周圍出現(xiàn)1-2mm的草綠色溶血環(huán)，紅細(xì)胞外形完整無缺。

β溶血：紅細(xì)胞的溶解在菌落周圍形成完全清晰透明的環(huán)。

γ溶血(即不溶血)：菌落周圍無溶血環(huán)。

雙環(huán)：在菌落周圍完全溶解的暈圈外有一個部分溶血的第二個圓圈。

(三)、半固體培養(yǎng)基：穿刺線及菌的擴散。

四、細(xì)菌L型的檢查

細(xì)菌L型的生物學(xué)性狀有其自身的特點，如形態(tài)多形性、染色不穩(wěn)定性以及生化反應(yīng)減弱等，檢驗時應(yīng)予注意，以防止工作中的漏診。

1、標(biāo)本采集應(yīng)盡量采集無雜菌污染的組織或體液標(biāo)本。胸水、腹水及尿液標(biāo)本，應(yīng)加20%蔗糖無菌溶液，以保持高滲;血液標(biāo)本應(yīng)接種高滲肉湯增菌培養(yǎng)。

2、培養(yǎng)方法

(1)檢查程序：將標(biāo)本接種到高滲肉湯增菌培養(yǎng)1-7天，然后轉(zhuǎn)種于型平板和平板37℃培養(yǎng)2-7天。

血L型菌在型瓊脂平板上典型菌落為“荷包蛋”樣，但從患者標(biāo)本中新分離的L型菌落常不典型，多呈顆粒型菌落，涂片染色為多形性。

加第一章 外界因素對細(xì)菌的影響

第一節(jié) 基本概念

一、消毒：殺死物體上的病原微生物。

二、滅菌：殺死物體上所有微生物(病原性、非病原性、繁殖體、芽胞)

三、無菌及無菌操作：無菌(指物體上不含活菌)，無菌操作：(防止微生物進入機體或其他物品的操作稱無菌操作)

四、防腐和抑菌：防止和抑制細(xì)菌物長繁殖的方法。

第二節(jié) 物理消毒滅菌法

一、熱力滅菌法：

(一) 高溫

1、干熱法：焚燒與燒灼(常用于接種環(huán)、接種針、瓶口和試管口)

干烤(160～170℃維持2h，常用于一般玻璃器皿、注射器、瓷器。)

2、濕熱法(優(yōu)點：易凝固蛋白;穿透力強;有潛熱。)

方法：⑴高壓蒸汽滅菌法：最有效的濕熱滅菌法;121.3℃，維持15-20min可殺滅所有細(xì)菌芽胞和繁殖體，適用于耐高溫、耐濕物品的滅菌，如普通培養(yǎng)基、生理鹽水、手術(shù)敷料等。

⑵ 煮沸法：如水中加入2%碳酸鈉，則可提高沸點至105℃，既殺死芽胞，又防止金屬器皿生銹。

⑶流通蒸汽滅菌法：

⑷間歇滅菌法：

⑸巴氏消毒法：用于牛奶和酒類的消毒。

(二)低溫在低溫條件下，細(xì)菌代謝活動降低不再繁殖，能較長時間維持生命，故常用于保存菌種。冷凍真空干燥是目前保存菌種的最好方法。

二、電磁波滅菌法：機理：干擾細(xì)菌DNA的復(fù)制而殺菌;特點：穿透力弱，可損傷皮膚、眼睛;適用于空氣及物體表面的除菌。

1、日光及紫外線 紫外線在波長265- 266nm時殺菌作用最強。

2、電離輻射

三、濾過除菌法： 濾過是以物理阻留方法將液體或空氣中的微生物除去。矽

器。過濾法用于不耐高溫物品滅菌。用于除菌的濾膜孔徑為0.22μm。

但除不去L型細(xì)菌、支原體、衣原體和病毒;適用于空氣、抗血清和生物制品的除菌。

第三節(jié) 化學(xué)消毒滅菌法

一、消毒劑的殺菌機制：消毒劑常用于人體體表、醫(yī)療器具、排泄物及周圍環(huán)境的消毒。殺菌機制多樣，主要有：使菌體蛋白凝固變性或干擾DNA的復(fù)制;干擾微生物酶系統(tǒng)并影響其代謝;損傷細(xì)胞膜，改變細(xì)胞膜的通透性。

二、影響消毒效果的因素：

(1)消毒劑的性質(zhì)、濃度和作用時間：如表面活性劑對革蘭陽性菌的殺菌效果要強于革蘭陰性菌。

(2)微生物的種類與狀態(tài)

(3)溫度與酸堿度

(4)環(huán)境中有機物質(zhì)的存在

加第二章 細(xì)菌的感染與免疫

感染：一定條件下，細(xì)菌侵入機體后與機體的防御功能相互作用所引起的不同程度的病理變化過程。

病原菌與非病原菌。

第一節(jié) 正常菌群與條件致病菌

一、正常菌群

細(xì)菌在自然界的分布：

細(xì)菌在正常人體的分布：

(1)正常菌群定義：正常人體的體表及與外界相通的腔道粘膜上存在一定種類和數(shù)量的細(xì)菌，免疫功能正常時通常對人體無害。

(2)生理學(xué)意義：促進消化;生物拮抗;營養(yǎng)作用;免疫作用;抑瘤作用;生長與衰老。

二、條件致病菌：

特定的致病條件：寄居部位的改變;機體免疫功能低;菌群失調(diào)。

第二節(jié) 細(xì)菌的致病性

致病性概念：細(xì)菌的致病性是指細(xì)菌引起疾病的能力，不同的病原菌對機體可引起不同的疾病。

病原菌的致病作用，與其毒力強弱、進人機體的數(shù)量，以及侵入部位是否合適有密切的關(guān)系。

一、細(xì)菌的致病因素

(一)、細(xì)菌的毒力：

1、侵襲力：病原菌突破宿主防御機能，在體內(nèi)定居、繁殖、擴散的能力。主要包括侵襲性酶類和菌體表面結(jié)構(gòu)。

2、毒素

外毒素:

(1)來源及化學(xué)組成：G 菌及部分G-菌生長繁殖過程中分泌出的蛋白質(zhì)。

(2)外毒素的主要特性有：①化學(xué)成分是蛋白質(zhì)，性質(zhì)不穩(wěn)定：易被熱、酸及蛋白酶破壞，②免疫原性強：可刺激機體產(chǎn)生抗體，稱為抗毒素。外毒素經(jīng)地。4%甲醛處理后脫去毒性仍保留免疫原性，稱為類毒素。。③毒性強，且有組織選擇性。

內(nèi)毒素:

(1)來源及化學(xué)組成：G-菌細(xì)胞壁的脂多糖(LPS)。LPS的化學(xué)結(jié)構(gòu)：特異性多糖、非特異性核心多糖、脂質(zhì)A

(2)內(nèi)毒素的主要特性有：①化學(xué)成分是脂多糖，性質(zhì)穩(wěn)定：②免疫原性弱：刺激機體產(chǎn)生抗體的能力弱，不能被甲醛脫去毒性成為類毒素。③毒性弱，且無組織選擇性：

(3)內(nèi)毒素的生物學(xué)作用有：①發(fā)熱反應(yīng)。②白細(xì)胞反.③內(nèi)毒素休克。④DIC。

二、細(xì)菌的數(shù)量：一般是病原體毒力愈強，引起感染所需的病原體量愈小;反之則愈大。

三、細(xì)菌的入侵門戶：

第三節(jié) 抗細(xì)菌免疫機制

一、天然免疫(非特異性免疫) 非特異性免疫是個體生來具有的天然防御機能。

特點：機體抗菌免疫的第一道防線，發(fā)揮作用快，但無特異性，也不因病原菌的再次刺激而增強。

組成：

(1)屏障結(jié)構(gòu)：包括物理屏障-皮膚黏膜、血腦、胎盤屏障，作用：機械性阻擋、分泌殺菌物質(zhì)?；瘜W(xué)屏障-補體、溶菌酶、乙型溶素、防御素、正常菌群拮抗。

(2)吞噬細(xì)胞：包括中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)。

二、獲得性免疫(特異性免疫)

特點：明顯的特異性和記憶性，可因可因再次接受相同抗原刺激而使免疫效應(yīng)增強。

組成：黏膜免疫系統(tǒng)、細(xì)胞免疫、體液免疫。

微生物感染的主要免疫類型：

(1)胞外菌感染：以中性粒細(xì)胞的吞噬、補體的調(diào)理溶菌及特異性抗體為主。

(2)胞內(nèi)菌的感染：以細(xì)胞免疫為主。

(3)外毒素的感染：以特異性抗毒素的中和作用為主。

第四節(jié) 感染的發(fā)生與發(fā)展

一、感染的來源： 內(nèi)源性 ;外源性

二、感染的方式與途徑：呼吸道、消化道、接觸、節(jié)肢動物為媒介及創(chuàng)傷感染。

三、感染的類型：

1、感染的類型：隱性感染;顯性感染;帶菌狀態(tài)。

2、顯性感染按病情緩急分為：急性感染(突然發(fā)作，病程較短，一般是數(shù)日至數(shù)周。)慢性感染(病程較長，常持續(xù)數(shù)月至數(shù)年。)

3、 按感染部位分為

(1)局部感染、

(2)全身感染：(病原體或其毒性代謝產(chǎn)物向全身播散引起全身性癥狀的一種感染類型。)

毒血癥：是病原菌在入侵的局部組織生長繁殖，僅其產(chǎn)生的毒素進入血流。

菌血癥：是病原菌由原發(fā)部位一時性或間歇性侵入血流，但不在血流中繁殖。

敗血癥：是病原菌侵入血流、大量繁殖并產(chǎn)生毒性代謝產(chǎn)物。

膿毒血癥：指化膿性病原菌侵入血流后，在其中大量繁殖，并通過血流擴散至機體的其他組織或器官，引起新的化膿性病灶。

一、碳水化合物的代謝試驗

1.糖(醇、苷)類發(fā)酵試驗：

接種的細(xì)菌，若能分解培養(yǎng)基中的糖(醇、苷)類產(chǎn)酸時，培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng)。若產(chǎn)氣可使液體培養(yǎng)基中導(dǎo)管內(nèi)或半固體培養(yǎng)基內(nèi)出現(xiàn)氣泡，固體培養(yǎng)基內(nèi)有裂隙等現(xiàn)象。若不分解，培養(yǎng)基中除有細(xì)菌生長外，無任何其他變化。

鑒定細(xì)菌最主要和最基本的試驗。

2.氧化-發(fā)酵試驗(O/F試驗)：主要用于腸桿菌科細(xì)菌與非發(fā)酵菌的鑒別，前者均為發(fā)酵型，而后者通常為氧化型或產(chǎn)堿型。

3.β-半乳糖苷酶試驗(ONPG試驗)：遲緩發(fā)酵乳糖菌株的鑒定。

碳水化合物的代謝試驗

4.七葉苷水解試驗：D群鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別，前者陽性，后者陰性。也可用于革蘭陰性桿菌及厭氧菌的鑒別。

5.甲基紅試驗：鑒別大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽性，后者為陰性。

6.V-P試驗：常與甲基紅試驗一起使用，因為前者為陽性的細(xì)菌，后者通常為陰性。

二、蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗

其理為不同種類的細(xì)菌分解蛋白質(zhì)的能力不同。細(xì)菌對蛋白質(zhì)的分解，一般先由胞外酶將復(fù)雜的蛋白質(zhì)分解為短肽(或氨基酸)，滲入菌體內(nèi)，然后再由胞內(nèi)酶將肽類分解為氨基酸。

1.明膠液化試驗

某些細(xì)菌可產(chǎn)生一種胞外酶-明膠酶，能使明膠分解成氨基酸，從而失去凝固力，半固體的明膠培養(yǎng)基成為流動的液體。

應(yīng)用：腸桿菌科細(xì)菌的鑒別。有些厭氧菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱類桿菌等也能液化明膠。另外多數(shù)假單胞菌也能液化明膠。

2.吲哚(靛基質(zhì))試驗

某些細(xì)菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸生成引噪(靛基質(zhì))，當(dāng)加入吲哚試劑(對位二甲氨基苯甲醛)后則形成紅色的玫瑰吲哚。

應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。

3.硫化氫試驗

某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸(如胱氨酸、半胱氨酸)產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇鉛或亞鐵離子則形成黑褐色的硫化鉛或硫化鐵沉淀。此試驗可間接檢測細(xì)菌是否產(chǎn)生硫化氫。

應(yīng)用：主要用于腸桿菌科中屬及種的鑒別。

4.尿素分解試驗

原理：某些細(xì)菌具有尿素分解酶，能分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基呈堿性。

應(yīng)用：主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細(xì)菌的鑒定。

5.苯丙氨酸脫氨酶試驗

某些細(xì)菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基，形成苯丙酸痛，加入氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反應(yīng)。

應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。

6.氨基酸脫羧酶試驗

具有氨基酸脫羧酶的細(xì)菌，能分解氨基酸使其脫羧生成胺(賴氨酸→尸胺，鳥氨酸→腐胺，精氨酸→精胺)和二氧化碳，使培養(yǎng)基變堿。使指示劑顯示出來。

應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。

三、碳源和氮源利用試驗

1.枸櫞酸鹽利用試驗：腸桿菌科中菌屬間的鑒定。

2.丙二酸鹽利用試驗：腸桿菌科中屬間及種的鑒別。

四、各種酶類試驗

1.氧化酶試驗：腸桿菌科細(xì)菌與假單胞菌的鑒別。

2.過氧化氫酶試驗(觸酶試驗)：革蘭陽性球菌初步分群。

3.硝酸鹽還原試驗：細(xì)菌鑒定中廣泛應(yīng)用。

4.脂酶試驗：厭氧菌的鑒別。

5.卵磷脂酶試驗：厭氧菌的鑒定。

6.DNA酶試驗：革蘭陽性球菌中只有金黃色葡萄球菌產(chǎn)生DNA酶，在腸桿菌科中沙雷菌和變形桿菌產(chǎn)生此酶。

7.凝固酶試驗：葡萄球菌鑒別。

8.CAMP試驗：鏈球菌中，只有B群鏈球菌CAMP試驗陽性。

9.膽汁溶菌試驗：肺炎鏈球菌與甲型鏈球菌的鑒別。

五、抑菌試驗

1.O/129抑菌試驗：弧菌科的屬間鑒別。

2.桿菌肽試驗：A群鏈球菌與非A群鏈球菌的鑒別。

3.奧普托欣試驗：肺炎鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別。

一、細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法——免疫學(xué)檢測

二、細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法——分子生物檢測

(一)核酸雜交

(二)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

(三)生物芯片技術(shù)

三、細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法——細(xì)菌毒素檢測

·內(nèi)毒素檢測：檢測革蘭陰性細(xì)菌感染。

常用鱟試驗。

·外毒素檢測：檢測革蘭陽性菌及部分陰性菌感染。

體內(nèi)及體外毒力試驗檢測。

四、細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法——動物實驗

·主要用途：分離和鑒定病原微生物;測定細(xì)菌的毒力;制備免疫血清;建立致病動物模型;動物的血液是配制細(xì)菌培養(yǎng)基的必需材料;用于生物制品或一些藥物的安全、毒性、療效檢驗。

·實驗動物：小鼠、豚鼠、家兔及綿羊等。

·接種方法：皮下/皮內(nèi)/肌內(nèi)/腹腔/靜脈/腦內(nèi)注射等。

1.標(biāo)本的采集和處理原則

(1)標(biāo)本采集的一般原則

(2)標(biāo)本的處理

2.細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查

(1)不染色標(biāo)本

(2)染色標(biāo)本

3.細(xì)菌分離培養(yǎng)和鑒定

(1)培養(yǎng)基的種類和選擇

(2)分離培養(yǎng)

(3)生化反應(yīng)

(4)鑒定

4.細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法

(1)免疫學(xué)檢測

(2)分子生物學(xué)檢測

(3)細(xì)菌毒素檢測

(4)動物實驗

一、微生物自動培養(yǎng)系統(tǒng)

1、自動血培養(yǎng)檢測系統(tǒng)

原理：檢測細(xì)菌和真菌生長時所釋放的二氧化碳來作為血液中有無微生物存在的指標(biāo)。

檢測技術(shù)：放射標(biāo)記、顏色變化(CO2感受器)、熒光技術(shù)和壓力檢測等。

適用：血培養(yǎng)，其他無菌部位標(biāo)本如腦脊液、胸水、腹水和關(guān)節(jié)液等。

儀器的基本結(jié)構(gòu)包括：①主機，恒溫孵育系統(tǒng)(全自動)、檢測系統(tǒng);②計算機及其外圍設(shè)備;③培養(yǎng)瓶;④抗凝劑和吸附劑。

影響因素：正確使用和定期維護;采血次數(shù);采血時間;采血量;采血方法;及時送檢;終末傳代。

2、自動分枝桿菌檢測系統(tǒng)

原理：檢測分枝桿菌生長時所釋放的C02或者所消耗的02作為標(biāo)本中有無微生物存在的指示。

檢測技術(shù)：放射標(biāo)記、顏色變化、熒光技術(shù)等。

二、微生物自動鑒定系統(tǒng)的原理

1、微生物數(shù)碼分類鑒定技術(shù)

基本原理：計算并比較數(shù)據(jù)庫內(nèi)每個細(xì)菌條目對系統(tǒng)中每個生化反應(yīng)出現(xiàn)的頻率總和。

(1)數(shù)據(jù)庫：已知臨床相關(guān)菌株按照對各種生化反應(yīng)的出現(xiàn)頻率事先編碼建立數(shù)據(jù)庫。

(2)數(shù)碼鑒定：計算未知菌對5種反應(yīng)的出現(xiàn)頻率。

(3)編碼：對未知菌編碼。

(4)查碼。

2、微生物自動鑒定系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)與性能

全自動微生物鑒定儀的主要結(jié)構(gòu)：

·充液/封口部件：標(biāo)本注入。

·讀數(shù)儀/孵箱：讀取樣本生長變化。

·計算機：分析資料儲存。

·鍵盤：輸入操作指令。

·打印機：顯示打印結(jié)果。

3、微生物自動鑒定系統(tǒng)的工作流程及操作要點

(1)菌種準(zhǔn)備：標(biāo)本處理，預(yù)實驗和菌落的選擇。

(2)接種：制備細(xì)菌懸液，接種。

(3)觀察及記錄結(jié)果。

(4)結(jié)果解釋。

三、自動藥敏檢測系統(tǒng)

1、微量稀釋法試驗系統(tǒng)

目前應(yīng)用最多的系統(tǒng)。

分類：計算機輔助手工系統(tǒng)、半自動系統(tǒng)、全自動系統(tǒng)。

原理：肉湯稀釋法;常采用比濁法檢測液體培養(yǎng)基中細(xì)菌生長。

結(jié)果：在抗菌藥物存在的情況下，濁度降低是細(xì)菌生長受抗菌藥物抑制的表現(xiàn)，而濁度增加表明細(xì)菌耐藥。

2、紙片擴散法閱讀系統(tǒng)

根據(jù)抗菌藥物敏感性試驗結(jié)果，閱讀平板抑菌圈及解釋結(jié)果。

系統(tǒng)掃描平板，通過圖形分析，5s內(nèi)確定抑菌圈直徑，根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)，轉(zhuǎn)化為敏感性結(jié)果(敏感、耐藥、中介)。