16S rRNA測序是利用高通量測序技術(shù)，通過檢查環(huán)境微生物（主要是細(xì)菌）16S特定可變區(qū)的豐度，以此鑒定生物標(biāo)本細(xì)菌群落的分類及豐度的一項技術(shù)。16S rDNA指細(xì)菌基因組中編碼核糖體16S rRNA分子對應(yīng)的DNA序列, 也就是16S rRNA的編碼基因。16S序列由9個高變區(qū)組成，中間穿插著保守區(qū)，是最常用的細(xì)菌分類標(biāo)準(zhǔn)（圖1）。通過提取環(huán)境樣品的DNA，擴(kuò)增其中16S rRNA基因，可以鑒定絕大多數(shù)細(xì)菌。

圖1 16S rRNA基因的9個可變區(qū)的分布情況

基于Illumina MiSeq平臺的16S rRNA測序可以一次性完成多個樣本的平行測序，提供生物樣本物種分類、物種豐度、種群結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、群落比較等諸多信息（圖2）。盡管使用16S rRNA 基因作為分子標(biāo)志物時也存在諸多問題,比如水平基因轉(zhuǎn)移、多拷貝的異質(zhì)性和基因擴(kuò)增效率的差異等,這些問題會直接或間接的影響到微生物群落組成和多樣性分析時的準(zhǔn)確性，然而瑕不掩瑜，近些年來隨著高通量測序技術(shù)及數(shù)據(jù)分析方法等的不斷進(jìn)步,大量基于16S rRNA 基因的研究使得微生物生態(tài)學(xué)得到了快速發(fā)展。16S rRNA數(shù)據(jù)結(jié)果與全基因組測序數(shù)據(jù)結(jié)果在分類和豐度的結(jié)果上整體相似，且同時擁有可控制性強(qiáng)，價格實惠和周期短等諸多優(yōu)點(diǎn)，16S rRNA 基因目前也是成為了最常用的生物標(biāo)志物,被廣泛應(yīng)用于微生物的系統(tǒng)進(jìn)化、分類及多樣性研究之中。

圖2 16S/18S/ITS測序流程示意圖

接下來的內(nèi)容將主要介紹一下在得到高通量測序數(shù)據(jù)之后，如何使用生物信息學(xué)技術(shù)來解釋16S rRNA測序數(shù)據(jù)，解答樣品微生物群落的分類和豐度。目前在已發(fā)表的文章之中，最有影響力的兩個生物信息學(xué)軟件包分別是QIIME和Mothur：這兩篇文章在SCI的引用次數(shù)加起來就高達(dá)19000次，幾乎每一篇16S相關(guān)的文章都與他們兩人相關(guān)。

圖3 QIIME和Mothur研發(fā)實驗室主要PI

但本文要著重提到的是還未發(fā)表的但已經(jīng)早已投入使用的QIIME2平臺。QIIME2是Rob Knight實驗室和Greg Caporaso實驗室（QIIME文章的第一作者，現(xiàn)在擁有獨(dú)立實驗室）共同開發(fā)的一款跨時代革命性的全新擴(kuò)增子微生物組分析流程。QIIME2的開發(fā)時間已經(jīng)超過三年，并已于2018年1月全面接檔QIIME1。盡管關(guān)于QIIME2的文章還沒有正式發(fā)表，但已經(jīng)有很多的實驗室開始使用發(fā)表文章（依舊引用QIIME1以表達(dá)心意）。QIIME2不是QIIME1的一個簡單升級，它是一次采用python3完全的重寫。QIIME2克服了幾乎所有的已知的缺點(diǎn)，把現(xiàn)已發(fā)表的評價最好的所有軟件或者分析方法都囊括其中，集眾家之長變成一個綜合的平臺體系。為什么這么說，讓我們來列舉一下QIIME2的優(yōu)點(diǎn)：

1. 安裝簡單：曾經(jīng)QIIME的安裝讓無數(shù)生信人競折腰，QIIME2引入了Miniconda軟件包管理器，沒有管理員權(quán)限也可以輕松安裝；同時發(fā)布了docker鏡像，下載即可運(yùn)行；

2. 多個操作使用平臺：支持命令行模式(q2cli)，也支持圖型用戶界面q2studio；還有Python用戶喜歡的Artifact API(類似IPython notebook)；

3. 分析流程化：分析流程更加標(biāo)準(zhǔn)化，不讓用戶盲然下面該做什么；

4. 可視化增強(qiáng)：QIIME后發(fā)制人，超越引用6964次的mothur流程，就是其可視化方面的優(yōu)勢，現(xiàn)可視化結(jié)果更加漂亮，且全新采用交互式圖形結(jié)果，點(diǎn)選可查看細(xì)節(jié)，更易于分析；

5. 方便合作：項目很少一個組可完成，多人多地結(jié)果圖表方便共享，適合當(dāng)下科研合作的需求；

6. 可擴(kuò)展：支持自定義功能并加入分析流程；高手可以自己寫包，加入QIIME2的流程中了；

7. 分析可重復(fù)：全新定義了文件系統(tǒng)，即包括分析數(shù)據(jù)、也包括分析過程和結(jié)果，每一步的結(jié)果，均可追溯全部分析過程，方便檢查和重復(fù)。

用我一個大牛朋友的話來說就是，QIIME2完全沒有缺點(diǎn)，看不到對手，它將是未來擴(kuò)增子分析的絕對分析標(biāo)準(zhǔn)。讓我們拭目以待QIIME2時代的到來！

鑒于此，我們將推出一系列免費(fèi)網(wǎng)絡(luò)直播講座，介紹QIIME2及其安裝和使用等細(xì)節(jié)，歡迎參加。2018年5月5日，將推出第一場。參加方式請點(diǎn)擊以下鏈接：學(xué)術(shù)公開課通知：《微生物擴(kuò)增子分析全新流程QIIME2介紹與使用實例》，5月5日

本文來自多篇文章的改寫和引用，特感謝以下參考文獻(xiàn)：

1.劉馳, 李家寶, 芮俊鵬, 安家興, 李香真.16S rRNA 基因在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用.生態(tài)學(xué)報,2015,35(9):2769-2788.

2.張國林, 蘇遠(yuǎn)科, 沈海英等. 16S rRNA/ITS 基因序列分析與微生物分類鑒定及其在藥品微生物質(zhì)量控制中的應(yīng)用. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2017, 34(10): 1489-1495.

3. Genewiz官網(wǎng)16S/18S/ITS測序及宏基因組測序介紹.

4.QIIME2中文幫助文檔(Chinese Manual).