撰文 | 蓁 灼

點(diǎn)評 | 徐平龍（浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院）

侯法建（中科院上海生化細(xì)胞所）

宿主的固有免疫系統(tǒng)通過模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）感應(yīng)入侵病原體激活免疫應(yīng)答從而達(dá)到清除病原體的目的。針對于RNA病毒的入侵，RIG-I（retinoic acid-inducible gene-I）受體識別胞質(zhì)病毒RNA并產(chǎn)生I型干擾素（type I interferons ，IFNs）及細(xì)胞因子【1,2】。然而，IFN的過度表達(dá)則會引發(fā)機(jī)體自身免疫性疾病的產(chǎn)生，因此，IFN的表達(dá)平衡調(diào)控是免疫學(xué)家關(guān)注的研究重點(diǎn)之一。

RIG-I的分子結(jié)構(gòu)包含N端CARDs（caspase activation and recruitment domains， CARDs）結(jié)構(gòu)域，DECH解旋酶結(jié)構(gòu)域與C端CTD（C-terminal domain，CTD）結(jié)構(gòu)域。靜息態(tài)的RIG-I分子以自身抑制狀態(tài)存在，其中CARD2結(jié)構(gòu)域結(jié)合于解旋酶結(jié)構(gòu)域的插入?yún)^(qū)；而當(dāng)病毒的5’三磷酸雙鏈RNA入侵后，CTD結(jié)構(gòu)域感應(yīng)并結(jié)合RNA，使得RIG-I分子轉(zhuǎn)變?yōu)殚_放構(gòu)象釋放CARDs結(jié)構(gòu)域，介導(dǎo)下游信號傳遞與免疫應(yīng)答【3】。因此，攜帶5’三磷酸的雙鏈RNA是激活RIG-I的要素之一【4】，然而RIG-1是否可以結(jié)合宿主自身RNA及其功能的研究目前處于空白狀態(tài)。

近年來，長非編碼RNA（long noncoding RNAs ，lncRNAs）通過與特定蛋白發(fā)生相互作用而參與眾多生理病理過程的研究愈發(fā)引人注目。利用紫外交聯(lián)免疫共沉淀測序技術(shù)（high-throughput sequencing of immunoprecipitated RNAs after cross-linking，CLIP-seq）在人與小鼠中分別鑒定到21073與1662組RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding protein ，RBP）- lncRNA互作關(guān)系【5】。然而，RBP-lncRNA互作關(guān)系在免疫與炎癥中發(fā)揮的作用目前尚未有研究報(bào)道。2014年，曹雪濤團(tuán)隊(duì)在Science發(fā)表研究論文，報(bào)道了長非編碼RNA–lnc-DC通過與轉(zhuǎn)錄因子STAT3相互作用促進(jìn)其磷酸化從而調(diào)控人類樹突細(xì)胞分化的過程，拓寬了研究人員對lncRNA參與免疫細(xì)胞分化及功能的認(rèn)知【6】。

4月26日，中國工程院院士、南開大學(xué)校長曹雪濤所率領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)在Cell雜志在線發(fā)表了題為Self-Recognition of an Inducible Host lncRNA by RIG-I Feedback Restricts Innate Immune Response的研究論文，發(fā)現(xiàn)了一種起源于宿主自身的，IFN誘導(dǎo)的新型長非編碼RNA-lnc-Lsm3b，lnc-Lsm3b可與病毒RNA競爭性結(jié)合RIG-I單體，在免疫應(yīng)答晚期發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，抑制RIG-I的活性。機(jī)制上來說，lnc-Lsm3b通過其多價(jià)的長莖結(jié)構(gòu)域結(jié)合RIG-I并阻止了其構(gòu)象變化從而抑制了下游信號傳遞。BioArt還特別邀請了從事相關(guān)研究的兩位專家對上述工作進(jìn)行精彩點(diǎn)評，以饗讀者！

在這項(xiàng)研究中，研究人員首先利用紫外交聯(lián)免疫共沉淀技術(shù)（UV cross-linking and RNA immunoprecipitation assay，UV-RIP）鑒定到了胞質(zhì)lnc-Lsm3b，lnc-Lsm3b作為Lsm3基因編碼的唯一成熟性lncRNA，在RNA病毒感染宿主時(shí)表達(dá)顯著升高且可與RIG-I發(fā)生結(jié)合，同時(shí)IFN也可誘導(dǎo)lnc-Lsm3b的表達(dá)。隨后，lnc-Lsm3b在RNA病毒感染的巨噬細(xì)胞內(nèi)可抑制RIG-I介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，阻抑IFN與抗炎因子的產(chǎn)生。與其他負(fù)調(diào)控因子在RIG-I信號通路早期發(fā)揮作用不同的是，lnc-Lsm3b阻止RIG-I引發(fā)的IFN的表達(dá)主要發(fā)生與抗病毒應(yīng)答晚期。進(jìn)一步地，研究人員在lnc-Lsm3b-/-敲除的小鼠中觀察到RNA病毒感染后，lnc-Lsm3b-/-敲除小鼠體內(nèi)的IFN在18-24小時(shí)的表達(dá)顯著升高，且病毒滴度顯著減少，證明了lnc-Lsm3b主要在抗病毒信號級聯(lián)反應(yīng)晚期有效抑制RIG-I的功能。

Lnc-Lsm3b參與RIG-I抗病毒信號通路主要是通過與RIG-I的CTD結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用，且lnc-Lsm3b與RIG-I的結(jié)合可以有效抑制病毒RNA-5’三磷酸雙鏈RNA結(jié)合RIG-I的CTD結(jié)構(gòu)域。因此，RIG-I的CTD結(jié)構(gòu)域作為兩種RNA重疊性結(jié)合區(qū)域可為兩者的競爭性結(jié)合提供分子基礎(chǔ)。機(jī)制上看，lnc-Lsm3b所擁有的多分支環(huán)狀結(jié)構(gòu)為其與病毒RNA競爭性結(jié)合RIG-I提供結(jié)合條件。對于RIG-I的結(jié)合，Lnc-Lsm3b相比于病毒dsRNA擁有更高的親和效率，因此可以結(jié)合細(xì)胞內(nèi)新合成的大部分RIG-I單體分子從而抑制信號的傳遞。

此外，研究人員探究發(fā)現(xiàn)，宿主自身對于lnc-Lsm3b的識別可以幫助RIG-I處于非激活狀態(tài)。lnc-Lsm3b通過穩(wěn)定RIG-I分子內(nèi)CARDs結(jié)構(gòu)域與解旋酶結(jié)構(gòu)域的相互作用，使得RIG-I分子在病毒刺激時(shí)處于自身抑制的結(jié)構(gòu)，干擾了CARDs結(jié)構(gòu)域與MAVS分子的相互作用。同時(shí)，在RNA病毒刺激中，由TRIM25介導(dǎo)的RIG-I K63泛素化在lnc-Lsm3b的作用下也受到抑制。因此，研究人員證實(shí)了宿主自身的lnc-Lsm3b是RNA病毒感染時(shí)RIG-I信號通路的強(qiáng)力負(fù)調(diào)因子。

總的來說，該研究的亮點(diǎn)在于不僅發(fā)現(xiàn)了一類新型的長非編碼RNA-lnc-Lsm3b并闡明了其抑制免疫反應(yīng)過度激活的機(jī)制，為人體lncRNA與免疫分子的相互作用提供了研究思路，也為自身免疫性疾病的治療與預(yù)后奠定了研究基礎(chǔ)。

專家點(diǎn)評

徐平龍（浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院教授，國家杰青）

Comments：核酸固有免疫識別機(jī)制及其誘導(dǎo)的干擾素（IFNs）以及后續(xù)的干擾素誘導(dǎo)基因（ISGs）的表達(dá)組成了脊椎動物重要的宿主防御系統(tǒng)，在抵抗病原微生物尤其是病毒感染中起關(guān)鍵作用。過度激活的核酸免疫識別則誘導(dǎo)細(xì)胞死亡、衰老以及炎癥、自身免疫等多種嚴(yán)重疾病。因此，宿主細(xì)胞對此“危險(xiǎn)識別”系統(tǒng)有極為繁復(fù)的調(diào)控和保險(xiǎn)機(jī)制，比如陳志堅(jiān)實(shí)驗(yàn)室2015年在Science報(bào)道的TBK1對其上游接頭蛋白MAVS、STING及TRIF的“逆向”識別與修飾，從而以信號的來源來決定信號的強(qiáng)度和廣度。但是，學(xué)界對核酸免疫識別信號的終止機(jī)制目前還所知相對甚少。

曹雪濤院士是核酸固有免疫識別調(diào)控機(jī)制的主要開拓者之一，尤其在鑒定該系統(tǒng)的表觀遺傳調(diào)控及蛋白修飾調(diào)控方面做出了一系列卓有成效的工作。曹雪濤院士最新發(fā)表在Cell的研究，以識別細(xì)胞質(zhì)中異源RNA的受體蛋白RIG-I為對象，鑒定了干擾素誘導(dǎo)基因（ISGs）之一的長聯(lián)非編碼RNA lnc-Lsm3b是核酸免疫識別的重要調(diào)控元件。Lnc-Lsm3b能夠通過自我識別機(jī)制，利用其長莖及多枝環(huán)狀的特殊結(jié)構(gòu)，作為誘餌富集多個(gè)RIG-I并限制其CARD結(jié)構(gòu)域的開放，從而競爭性地抑制RIG-I對病毒RNA的識別，構(gòu)成了核酸免疫識別機(jī)制后期的負(fù)反饋調(diào)控。這項(xiàng)工作不僅首次鑒定了lncRNA是核酸固有免疫識別及炎癥調(diào)控的重要調(diào)控元件，也揭示了lncRNA在哺乳動物抗病毒中的關(guān)鍵功能，因此是核酸免疫識別調(diào)控以及l(fā)ncRNA功能研究觀念上的重要突破。這項(xiàng)工作同時(shí)也進(jìn)一步證實(shí)了RIG-I這一重要“異源”RNA受體也能夠有效識別并結(jié)合宿主細(xì)胞“自身”RNA，驗(yàn)證了長期以來領(lǐng)域內(nèi)的猜測。工作深化了我們對RIG-I這一關(guān)鍵RNA識別受體調(diào)控復(fù)雜性的認(rèn)識，也提出了通過調(diào)節(jié)lncRNA進(jìn)行抗病毒或抗炎癥治療的創(chuàng)新思路。

由于lncRNA普遍的低豐度，其是否具有實(shí)質(zhì)功能在業(yè)界仍然有非常大的爭論。曹雪濤院士的工作表明細(xì)胞內(nèi)生成的約250個(gè)拷貝的lnc-Lsm3b，通過其“一對多”的結(jié)合特性，能夠富集宿主細(xì)胞內(nèi)所有新誘導(dǎo)生成的RIG-I。這一有力證據(jù)從而給lncRNA的功能研究提供了重要啟示。

侯法建（中科院上海生化細(xì)胞所PI，青年千人）

Comments：干擾素信號通路在宿主細(xì)胞防御病毒侵染中發(fā)揮重要作用，其中RIG-I是定位于細(xì)胞質(zhì)中的模式識別受體，RIG-I結(jié)合病毒相關(guān)的RNA后激活下游信號通路、誘導(dǎo)干擾素的表達(dá)。干擾素通過誘導(dǎo)幾百個(gè)基因（ISG）的表達(dá)從而發(fā)揮抗病毒功能，RIG-I也是ISG之一。以前人們猜測，RIG-I在病毒感染后期的上調(diào)表達(dá)可能會進(jìn)一步放大抗病毒天然免疫反應(yīng)，以徹底抑制病毒侵染。另一方面，過度的天然免疫反應(yīng)可能導(dǎo)致過度炎癥以及相關(guān)疾病，因此，近年大量的研究工作關(guān)注對RIG-I信號通路的下調(diào)。曹老師的工作（Cell,2018）發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的ISG，即長非編碼RNA lnc-Lsm3b，能夠抑制RIG-I的激活。

以前的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究表明，RIG-I的N端結(jié)構(gòu)域CARD與中間的解旋酶結(jié)構(gòu)域以及C端結(jié)構(gòu)域CTD相互作用，處于非活性的“封閉”狀態(tài)；RIG-I結(jié)合病毒RNA以后，釋放其N端的CARD結(jié)構(gòu)域，從非活性的“封閉”狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘摹伴_放”狀態(tài)；而lnc-Lsm3b能夠穩(wěn)定CARD與解旋酶結(jié)構(gòu)域以及CTD結(jié)構(gòu)域的相互作用，從而阻止其激活，表明相對于病毒RNA，RIG-I對lnc-Lsm3b具有更高的親和力。這項(xiàng)研究解釋了在病毒感染后期RIG-I作為ISG而不能誘導(dǎo)產(chǎn)生更多干擾素的現(xiàn)象。這是曹老師實(shí)驗(yàn)室繼前期發(fā)現(xiàn)Siglec-G降解RIG-I后（Cell,2013），在RIG-I信號通路負(fù)調(diào)節(jié)領(lǐng)域的又一力作。