小編又要開始放大招啦。

從現(xiàn)在起，小編將會陸續(xù)進行科研思路分享系列，今天給大家推薦的是m6A RNA甲基化第一部分，下周是甲基化第二部分，隨后是gRNA文庫、外泌體、自噬等相關(guān)內(nèi)容，如果各位有其他需求的可以留言給我們哦。

m6A RNA甲基化

近年來，科學(xué)家們首次發(fā)現(xiàn)了一種可逆的RNA甲基化—m6A，即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子發(fā)生甲基化修飾（N6-methyladenosine，m6A）。研究發(fā)現(xiàn)，m6A是真核生物mRNA上最常見的一種轉(zhuǎn)錄后修飾，m6A在細胞加速mRNA代謝和翻譯，以及在細胞分化、胚胎發(fā)育和壓力應(yīng)答等過程中起重要作用。

整體研究思路

關(guān)于m6A甲基化的研究，目前有多種思路可供選擇。下面提供的思路供大家參考，但是針對所提的研究方法可以根據(jù)自身實驗設(shè)計進行延伸和拓展。

• 先從原有的表達譜芯片數(shù)據(jù)或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，挖掘到差異表達的甲基化酶；

• 對挖掘到的甲基化酶如METTL3或FTO等進行qPCR驗證，并進行m6A-seq分析哪些基因甲基化水平發(fā)生改變；

• 在細胞（動物模型可選）中對這些酶進行敲低和過表達，進行常規(guī)的qPCR和WB檢測相關(guān)酶表達情況，并用LC-MS/MS法檢測RNA整體m6A水平；

• 繼續(xù)對這些敲低和過表達的細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序/小RNA測序或表達譜芯片/小RNA芯片，分析哪些基因出現(xiàn)差異表達變化和可變剪切變化；

• 找到甲基化酶調(diào)控的靶基因，進行敲低和過表達，看甲基化酶缺陷的細胞或動物模型表型能否補救；

• 在確定上一步靶基因確實受到甲基化酶調(diào)控后，對靶基因上的motif進行點突變后進行驗證；

• 鑒定新型的甲基化酶（可選）。

• 直接進行m6A-seq和轉(zhuǎn)錄組測序，找到時間順序或差異表達的基因并用qPCR、WB等方法驗證，此外找到m6A有差異的基因；

• 對甲基化酶進行敲低和過表達，檢測RNA整體的m6A水平，之后可進行轉(zhuǎn)錄組或小RNA測序等方法檢驗甲基化酶敲低和過表達對mRNA或miRNA整體的影響，并著重研究第一步中感興趣的m6A有差異的靶基因；

• 對靶基因進行敲低或過表達，是否能夠?qū)谆府惓１磉_后的表型進行恢復(fù)；

• 對靶基因上motif進行點突變后進一步確認直接受到甲基化酶調(diào)控；

• 鑒定新型的甲基化酶（可選）。

論文發(fā)表要求分類

1-4 分雜志

實驗要求：通常4分左右的雜志，標(biāo)配是轉(zhuǎn)錄組測序搭配m6A-seq，最后通過對m6A-seq中的數(shù)據(jù)和圖表進行羅列后就能發(fā)表一篇小論文了。這一類雜志和文章的要求通常不會含有太多的后期驗證實驗，基本上是對測序結(jié)果進行羅列展示以及配合qPCR或LC-MS/MS就差不多了。

實驗手段：m6A-seq、轉(zhuǎn)錄組測序/表達譜芯片、qPCR、LC-MS/MS或m6A比色法、小 RNA 測序/小RNA芯片（可選）。

推薦雜志：BMC Genomics、RNA Biology 等二區(qū)/三區(qū)雜志。

參考文獻：Tao, X., et al. (2017). Transcriptome-wide N6-methyladenosine methylome profiling of porcine muscle and adipose tissues reveals a potential mechanism for transcriptional regulation and differential methylation pattern. BMC Genomics, 18(1), 336.

5-7 分雜志

實驗要求：擺脫了羅列測序結(jié)果的粗暴做法，這類分數(shù)的雜志會要求加入細胞實驗，動物實驗為可選方案。通常的做法是對幾種甲基化酶進行敲低、敲除和過表達后，進行一系列的細胞實驗。同時對幾種感興趣的靶基因進行qPCR和WB等驗證，并對整體mRNA的m6A 水平進行檢測。另外，對幾種甲基化酶敲低和過表達后，還可以再用測序或芯片等手段來觀察究竟哪些基因或小RNA受到了影響。

實驗手段：m6A-seq、轉(zhuǎn)錄組測序/表達譜芯片、LC-MS/MS或m6A比色法、小RNA測序/小 RNA芯片、qPCR、WB、敲低/過表達、動物實驗（可選）。

推薦雜志：Cell Death & Disease等二區(qū)雜志。

參考文獻：Warda, A. S., et al. (2017). Human METTL16 is a N6-methyladenosine (m6A) methyltransferase that targets premRNAs and various non-coding RNAs. EMBO Reports, e201744940.

10 分上下雜志

實驗要求：在7分雜志的要求再上了一個檔次與要求，在前面的基礎(chǔ)上需要鑒定出究竟哪些靶基因受到了甲基化酶的調(diào)控。然后對這些靶基因進行敲除、敲低和過表達實驗，觀察是否對甲基化酶表達異常的表型能夠進行補救。接下來需要對靶基因上的motif進行點突變驗證是否真的受到甲基化酶調(diào)控。同時mRNA在出核速度、半衰期等方面也要進行實驗進行佐證。

實驗手段：m6A-seq、轉(zhuǎn)錄組測序/表達譜芯片、LC-MS/MS或m6A比色法、小RNA測序/小 RNA芯片、qPCR、WB、敲低/過表達、靶基因驗證、動物實驗（可選）。

推薦雜志：Nature Communications、Nucleic Acids Research、eLife 等一區(qū)雜志。

參考文獻：Roundtree, I. A., et al. (2017). YTHDC1 mediates nuclear export of N6-methyladenosine methylated mRNAs. eLife,6, e31311.

20 分以上雜志

實驗要求：在先前10分雜志的基礎(chǔ)上加入動物實驗。這類文章通常包含幾個特點，即物種首次報道，鑒定出新型的蛋白，報道新的通路與機制，闡釋臨床問題等。這需要研究者們對科學(xué)問題有足夠的敏感度，在原先的研究基礎(chǔ)上進行更加深入的挖掘。

實驗手段：m6A-seq、轉(zhuǎn)錄組測序/表達譜芯片、LC-MS/MS或m6A比色法、小RNA測序/小RNA芯片、qPCR、WB、敲低/過表達、靶基因驗證、動物實驗、臨床實驗/藥物實驗。

推薦雜志：Cancer Cell、 Nature Immunology、 Cell 等頂級期刊。

參考文獻：Li Z, et al. (2017). FTO plays an oncogenic role in acute myeloid leukemia as a N6-methyladenosine RNA demethylase. Cancer Cell, 31(1), 127.

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