文末有【彩蛋】

CNS上的一些文章就是測(cè)測(cè)序、分析分析，用錢砸出來的嗎？沒錢不行，可是光有錢就行嗎？Data driven，PLOS ONE的趕腳；我們崇尚hypothesis driven。我的課題要做成hypothesis driven，不要data driven。真實(shí)世界哪分得那么清楚？

今天小丫跟大家分享一篇典型的data driven + hypothesis driven 逐步深入的文章，從機(jī)制到臨床靶標(biāo)。每一塊內(nèi)容拆分出來，都是一篇10分的paper。上周發(fā)表于Cell，這兩篇預(yù)熱貼《Cell的模式圖畫反，反，反了》，《RNA-seq居然能挖出這么多機(jī)制！給你的文章加5分》說的就是它：

Chen, H., Li, C., Peng, X., Zhou, Z., Weinstein, J.N., Liang, H. and Cancer Genome Atlas Research Network, 2018. A Pan-Cancer Analysis of Enhancer Expression in Nearly 9000 Patient Samples. Cell, 173(2), pp.386-399.

《用別人的數(shù)據(jù)發(fā)自己的Science | 給你的文章加5分》一文用別人的ChIP-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)MYC通過結(jié)合PD-L1的promoter調(diào)控抗腫瘤免疫應(yīng)答。本文用TCGA的RNA-seq數(shù)據(jù)，找到了調(diào)控PD-L1的enhancer，揭示了PD-L1的遠(yuǎn)距離調(diào)控機(jī)制。

思路：

第一步，Data driven

TCGA產(chǎn)生了那么多癌癥數(shù)據(jù)，如何有效利用？我對(duì)enhancer感興趣，能用TCGA的RNA-seq數(shù)據(jù)找active enhancer嗎？先總體看看這些數(shù)據(jù)適不適合分析enhancer expression（Figure 1），結(jié)果還不錯(cuò)。發(fā)現(xiàn)：跟對(duì)照相比，腫瘤組織有著更廣泛的enhancer activation。

enhancer expression是啥，跟RNA-seq有啥關(guān)系？你需要補(bǔ)習(xí)這篇《RNA-seq居然能挖出這么多機(jī)制！給你的文章加5分》

Figure 1. Overview of Enhancer Expression in TCGA RNA-Seq Data

接下來整合其他高通量數(shù)據(jù)，看看能找到什么線索。TCGA除了RNA-seq以外，還有CNV和mutation數(shù)據(jù)，整合這些數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)：腫瘤組織enhancer的激活與腫瘤非倍性呈正相關(guān)，而與點(diǎn)突變無關(guān)或輕微負(fù)相關(guān)（Figure 2）。

Figure 2. Enhancer Expression Is Associated with Different Types of Genomic Aberration

第二步，hypothesis driven

Data driven發(fā)現(xiàn)了有趣的規(guī)律：腫瘤組織enhancer的激活與腫瘤非倍性呈正相關(guān)，機(jī)制是什么呢？

提出假設(shè)：非整倍性導(dǎo)致染色質(zhì)開放，從而導(dǎo)致enhancer激活（Figure 3A）。

怎樣證實(shí)這個(gè)假設(shè)呢？

既然model里的關(guān)鍵點(diǎn)是染色質(zhì)狀態(tài)，那就要用到open和closed chromatin的marker，用ATAC-seq和H3K27ac的ChIP-seq數(shù)據(jù)標(biāo)識(shí)open chromatin，用H3K9me2和H3K9me3標(biāo)識(shí)closed chromatin。對(duì)比發(fā)現(xiàn)：open和closed染色質(zhì)的雙鏈突變率（DSB rate）和點(diǎn)突變率的確呈現(xiàn)相反趨勢(shì)（Figure 3B）。進(jìn)一步整合Hi-C數(shù)據(jù)，證實(shí)DNA-DNA interection多的區(qū)域 DSB密度高，enhancer密度也高 （Figure 3C），再次證實(shí)了假設(shè)模型（Figure 3E）。

open chromatin跟轉(zhuǎn)錄調(diào)控有什么關(guān)系？ATAC-seq、H3K27ac、H3K9me2和H3K9me3跟染色質(zhì)狀態(tài)有什么關(guān)系？你需要補(bǔ)習(xí)這篇《等我有錢了，我也這樣研究一個(gè)基因》里的兩個(gè)視頻。

Figure 3. A ‘‘Chromatin-State’’-Centered Mechanistic Model for the Interplay among Enhancer Activation, SCNAs, and Point Mutations

第三步，深入挖掘機(jī)制

上面的“非整倍性-open chromatin-active enhancer”模型最后影響了哪些關(guān)鍵基因，從而在癌癥發(fā)生發(fā)展中起決定性作用呢？要揭示enhancer的功能，就要跟enhancer調(diào)控的基因聯(lián)系起來，從共表達(dá)模式入手可以找到enhancer的靶基因。

作者整合了enhancer和mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，找出co-expression的gene和enhancer。這些gene和enhancer可能通過以下三種方式產(chǎn)生co-expression效果（Figure 4A）：

模型一：causal relationship，enhancer的激活導(dǎo)致基因差異表達(dá)；

模型二：reactive relationship，基因位于enhancer上游；

模型三：co-responsive relationship，基因和enhancer都受其他分子的影響。

作者重點(diǎn)關(guān)注模型一，因?yàn)槟Ｐ鸵皇侵苯诱{(diào)控機(jī)制。從兩方面著手：

首先看調(diào)控，enhancer突變是否導(dǎo)致基因表達(dá)的變化（eQTL）；

然后看結(jié)合，enhancer跟gene是否形成loop（Hi-C）（Figure 4B）。

找到了65個(gè)這樣的interactions，包括49個(gè)enhancer和47個(gè)gene（Figure 4C），其中有22個(gè)已知的原癌基因和8個(gè)抑癌基因（Figure 4D），80%的gene-enhancer interaction是正調(diào)控。鑒定出的gene-enhancer調(diào)控有可能是癌癥發(fā)展中的關(guān)鍵因素，有潛力成為候選靶標(biāo)，用于臨床治療。接下來選其中兩個(gè)enhancer，深入研究。

你也想通過分析轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和共表達(dá)，來挖轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系？強(qiáng)烈推薦這個(gè)整合了ChIP-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)的在線挖機(jī)制工具《去TCGA看表型，來CistromeCancer挖機(jī)制》

Figure 4. Systematic Identification of Causal Enhancer and Cancer-Gene Interactions

第四步，挖掘臨床價(jià)值

作者選了兩個(gè)enhancer，深挖其臨床價(jià)值。

No.1 位于chr22的enhancer，簡(jiǎn)稱它為enhancer 22，SYK可能是它的靶基因。從三個(gè)方面著手挖掘enhancer 22的功能：

1. 哪些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在enhancer 22上？查看ENCODE的ChIP-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)有大量的轉(zhuǎn)錄因子在這個(gè)enhancer上有結(jié)合信號(hào)，預(yù)示著這里是調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的熱點(diǎn)hub（Figure 5A），原理看這篇《他中了國自然，因?yàn)樽詈笠恢苎a(bǔ)了這張圖》。

2. enhancer 22的變異會(huì)影響基因表達(dá)嗎？先看轉(zhuǎn)錄水平，查eQTL，發(fā)現(xiàn)有3個(gè)SYK的eQTL。這兩個(gè)在線工具教你查eQTL《變異會(huì)影響轉(zhuǎn)錄？SNP影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合？RegulomeDB》，《non-coding區(qū)的SNP影響了轉(zhuǎn)錄？HaploReg視頻》（Figure 5BC）。再看蛋白質(zhì)水平，查TCGA的蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)，跟轉(zhuǎn)錄水平一致，enhancer activity跟SYK蛋白表達(dá)水平正相關(guān)（Figure 5DE）。

3. enhancer 22的變異影響了患者的生存期嗎？在很多癌癥類型里，enhancer 22變異患者的預(yù)后都很差（Figure 5F-K）。這里有方法：《TCGA，她已經(jīng)用了七年 | 資深用戶深度點(diǎn)評(píng)》

至此，挖掘出enhancer 22的臨床價(jià)值：利用enhancer 22調(diào)控SYK的這一特點(diǎn)，把enhancer 22作為癌癥診斷的分子marker。僅這一部分就是一項(xiàng)完整的研究，妥妥的10分paper。

Figure 5. Enhancer 22 as a Prognostic Marker across Cancer Types

No.2，位于PD-L1下游140kb處，簡(jiǎn)稱enhancer 9。從以下五個(gè)方面挖掘其功能：

1. 共表達(dá)分析：多種癌癥類型中，以及130種肺癌細(xì)胞系中，enhancer 9與PD-L1有著強(qiáng)co-expression（Figure 6AB）。

2. enhancer 9的變異引起PD-L1的表達(dá)變化嗎？答案是肯定的（Figure 6C）。

3. enhancer 9和PD-L1之間能形成loop嗎？7種人細(xì)胞系的Hi-C數(shù)據(jù)證實(shí)，enhancer 9和PD-L1之間形成了DNA-DNA結(jié)合（Figure 6D）。

4. 哪些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在enhancer 9上？ENCODE的161種轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)當(dāng)中，只有NF-kB在enhancer 9上有結(jié)合信號(hào)，同時(shí)NF-kB在PD-L1的promoter上也有結(jié)合信號(hào)（Figure 6E），這再次證實(shí)了NF-kB介導(dǎo)了enhancer 9和PD-L1的遠(yuǎn)距離調(diào)控。

5. 敲除實(shí)驗(yàn)證實(shí)enhancer對(duì)靶基因的調(diào)控。采用經(jīng)典的研究單個(gè)enhancer對(duì)靶基因調(diào)控作用的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)敲除了enhancer 9的細(xì)胞中，PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)確實(shí)降低（Figure 6F-H）。

至此，揭示了一個(gè)NF-kB介導(dǎo)PD-L1激活的enhancer-promoter相互作用模型。僅這一部分又是一篇10分paper。

Figure 6. Enhancer 9 Regulates PD-L1, a Key Target of Immunotherapy

最后，看看本文一共整合分析了這么多數(shù)據(jù)，文中都有鏈接

【彩蛋】

本文通訊作者梁晗，副教授，美國德州大學(xué)MD安德森癌癥中心生物信息與計(jì)算生物系。

2015年，小丫參加了梁晗老師主講的龍星課程，課程主題就是TCGA，http://210.46.85.200/dragonstar/，對(duì)課程ppt感興趣的小伙伴可以聯(lián)系嘉因表觀小助手，微信號(hào)：epigenomics