雖然人體能夠產(chǎn)生千千萬萬種抗體，但在我們利用抗體進(jìn)行疾病的診斷、治療及預(yù)防時，更多情況下需要特異性強(qiáng)、結(jié)構(gòu)均一、可重復(fù)大量生產(chǎn)的高純度抗體。單克隆抗體的出現(xiàn)，解決的抗體制備過程中的特異性和可重復(fù)性問題，得到了廣泛的應(yīng)用。

這里介紹單克隆抗體的制備及幾種常見的基因工程抗體。

一、單克隆抗體的制備

自單克隆抗體制備技術(shù)問世以來，其制備程序基本類似[1]：

首先用提純過的免疫原對健康小鼠進(jìn)行免疫。免疫劑量、途徑與間隔時間的選擇，均以獲得高效價抗體為最終目的。在一定劑量范圍內(nèi)，免疫原劑量越大，產(chǎn)生的抗體效價越高。一般被免疫動物的血清抗體效價越高，融合后細(xì)胞產(chǎn)生高效價特異抗體的可能性越大，而且單克隆抗體的質(zhì)量（如濃度、親和力等）也與免疫過程中小鼠血清抗體的效價和親和力密切相關(guān)。末次免疫后3～4天，分離小鼠脾細(xì)胞（B細(xì)胞）以進(jìn)行融合。

與小鼠細(xì)胞進(jìn)行融合的理想的骨髓瘤細(xì)胞株需滿足以下要求：1.細(xì)胞株穩(wěn)定，易于傳代培養(yǎng)；2.細(xì)胞株自身不會產(chǎn)生抗體或細(xì)胞因子；3.該細(xì)胞是次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)換酶（hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase，HGPRT）的缺陷株。此外，需與免疫小鼠同源。

融合細(xì)胞應(yīng)處于對數(shù)生長期、細(xì)胞形態(tài)、活性佳。在體外培養(yǎng)條件下，細(xì)胞的生長依賴適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度，因而在培養(yǎng)融合細(xì)胞或細(xì)胞克隆化培養(yǎng)時，還需加入其他飼養(yǎng)細(xì)胞。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞為小鼠的腹腔細(xì)胞，亦有用小鼠的脾細(xì)胞、大鼠或豚鼠的腹腔細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞的。

    細(xì)胞融合是產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞的中心環(huán)節(jié)。目前，通常選擇PEG用于促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞融合，其原理可能是PEG導(dǎo)致細(xì)胞膜脂類物質(zhì)物理結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜容易打開，有助于細(xì)胞融合。融合反應(yīng)后，用培養(yǎng)液稀釋，消除PEG的作用。

融合后的細(xì)胞進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)添加次黃嘌呤（hypoxanthine，H）、甲氨蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）。骨髓瘤細(xì)胞合成DNA通常有兩條途徑，一是利用糖和氨基酸合成核苷酸進(jìn)而合成DNA，甲氨蝶呤可阻斷該途徑；當(dāng)甲氨蝶呤存在時，細(xì)胞通過HGPRT和TK（胸腺嘧啶核苷激酶）利用核苷酸的前提合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA。因此，在HAT培養(yǎng)液中，未能雜交的骨髓瘤細(xì)胞由于DNA合成途徑分別被甲氨蝶呤和HGPRT代謝缺陷所阻斷，導(dǎo)致不能合成完整的DNA，不能增殖而死亡。未能雜交的脾細(xì)胞（指B細(xì)胞）在一般培養(yǎng)基中不能生長繁殖，5～7天內(nèi)死亡。所以，HAT培養(yǎng)一周左右，僅成功融合的雜交瘤細(xì)胞能夠存活，達(dá)到選擇培養(yǎng)的目的。對HAT選擇培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行稀釋，選擇高抗體分泌的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)或凍存待用。

大量制備單克隆抗體的方法有動物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法。在動物體內(nèi)誘生法中，通常選擇小鼠作為產(chǎn)抗動物，小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，誘生出腹腔腫瘤并產(chǎn)生含單克隆的腹腔積液。在體外培養(yǎng)發(fā)中，可將雜交瘤細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，或進(jìn)行高密度培養(yǎng)，如利用發(fā)酵罐或細(xì)胞固定化培養(yǎng)系統(tǒng)，產(chǎn)量可明顯增加。

    單克隆抗體可按所要求的純度不同采用相應(yīng)的純化方法。一般采用鹽析、凝膠過濾和離子交換層析等步驟達(dá)到純化目的，也有采用較簡單的酸沉淀方法。目前最有效的單克隆抗體純化方法為親和純化法。

二、基因工程單克隆抗體

最初制備成功的單克隆抗體為鼠源性抗體，盡管鼠源抗體親和力強(qiáng)，但在治療和檢測方面都存在一定的缺陷。

鼠源單抗與NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面Fc段受體親和力弱，產(chǎn)生的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）較弱，而且它與補(bǔ)體成分結(jié)合能力低，對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力較弱。此外鼠單克隆抗體還具有免疫原性，易引起宿主人抗鼠抗體（HAMA）反應(yīng)[2,3]。這樣一方面降低了單抗的效價，另一方面又會給病人帶來不良反應(yīng)，因此鼠源性單克隆抗體在運(yùn)用臨床治療前還需改善。同樣由于HAMA反應(yīng)，在疾病診斷過程總中使用鼠源抗體會導(dǎo)致部分樣本出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

    因此，在鼠源抗體的基礎(chǔ)上，人們對其編碼DNA進(jìn)行重組，使抗體部分或全部由人類基因所編碼，降低其免疫原性，制備了人-鼠嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。

 （A）  IgG分子中Fab片段與Fc片段

 （B）  非人源、人-鼠嵌合、人源化及全人源抗體的Fab片段來源

人-鼠嵌合抗體：是用人源基因代替鼠源單抗的恒定區(qū)。這樣，不僅保留了抗原抗體結(jié)合的特異性，又能夠大大降低鼠源單抗的免疫原性。其制備原理是，將功能性抗體輕、重鏈可變區(qū)基因分別與人抗體的κ鏈和重鏈C_H1恒定區(qū)基因進(jìn)行重組，克隆到表達(dá)載體中，構(gòu)建成鼠－人嵌合的Fab 基因表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞表達(dá)。第一個用于腫瘤治療的基因工程抗體藥物美羅華（Rituximab）就是由鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)組成的嵌合抗體。但由于嵌合抗體可變區(qū)（V）仍占整個抗體分子的30%，鼠源性部分的框架區(qū)（FR）依舊有一定的免疫原性，仍可能誘發(fā)HAMA反應(yīng)。

    人源化抗體：對人-鼠嵌合抗體進(jìn)一步進(jìn)行人源化，主要手段是重構(gòu)抗體和表面重塑技術(shù)[4]。重構(gòu)抗體即互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）的移植，將鼠抗體的CDR移植到人抗體的相應(yīng)部位，可使抗體人源化程度達(dá)到90%以上，是目前人源化單抗較常用的方法。表面重塑技術(shù)是將鼠源抗體FR部分表面氨基酸殘基進(jìn)行人源化改造，以人抗體表面相似氨基酸替換鼠源FR部分與人抗體中差別明顯的部分，這種方法能夠在最大程度上維持抗體選擇性親和力的同時減少異源性。

全人源抗體：雖然人源化抗體極大的解決了鼠源性抗體的免疫原性問題，但生產(chǎn)過程中仍有一定的困難。人源化過程需要大量繁復(fù)的計算機(jī)模擬，并進(jìn)行不同的氨基酸取代以保持抗體的選擇性親和力，工作量巨大。并且，人源化抗體依舊含有少量鼠源性成分，仍可能引起HAMA反應(yīng)等。相比之下，所有序列都來源于人的全人源抗體安全性更好，被認(rèn)為是用于治療的理想抗體。目前主要通過3種途徑來研制：噬菌體抗體庫、核糖體展示技術(shù)及轉(zhuǎn)基因小鼠制備人源性抗體。

三、小分子抗體及其特性

在單克隆抗體及其人源化的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步降低免疫原性、降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)量、優(yōu)化抗體穩(wěn)定性等，研發(fā)了各種小分子基因工程抗體。主要包括Fab片段、單鏈抗體及單域抗體。

Fab片段：抗體的可變區(qū)，是抗體識別與結(jié)合抗原的片段，完整的抗體分子經(jīng)酶消化后，可生成Fab與Fc兩種不同片段，如圖3。用于酶切抗體的酶主要包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和無花果蛋白酶[6]。其中木瓜蛋白酶消化IgG抗體是用于獲得Fab最傳統(tǒng)的方法。

Fab分子無需糖基化，可使用原核系統(tǒng)如大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)。因大腸桿菌周質(zhì)能提供氧化環(huán)境及形成二硫鍵所需的硫醇-二硫鍵氧化還原酶，由大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)所產(chǎn)Fab片段均具有完整的立體折疊和鏈內(nèi)、鏈間二硫鍵，保留抗體識別與結(jié)合抗原的能力[5]。Fab片段抗體無Fc片段，極大的降低了其免疫原性，但也因此作為藥物在人體內(nèi)降解迅速，半衰期短。為延長Fab半衰期，可將Fab片段與蛋白結(jié)合或?qū)⑵銹EG化。

單鏈抗體（single chain Fv，ScFv）：由抗體重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL通過一段連接肽（linker）連接形成的一條單一的多肽鏈，是親代抗體全部抗原結(jié)合特異性的最小功能結(jié)構(gòu)單位。與Fab相同，ScFv沒有恒定區(qū)片段，不需要進(jìn)行糖基化，因此可在原核系統(tǒng)中表達(dá)，最常用的表達(dá)受體為大腸桿菌[8]。ScFv的主要優(yōu)點(diǎn)包括：易于構(gòu)建和表達(dá)、分子質(zhì)量小、穿透力強(qiáng)、特異性好、免疫原性低。但同時，ScFv也有一些缺點(diǎn)，主要包括親和力較低，較其親本單克隆抗體，親和力低10-1000倍；穩(wěn)定性較差，尤其在37℃時，常有聚集傾向；半衰期短[9]。

單域抗體(single domain antibodys, sdAb)：是基于單一結(jié)構(gòu)域的識別單元，這種抗體的親和性較低，還需進(jìn)行優(yōu)化。用基因工程方法獲得的sdAb主要有三類：

第一類是從駱駝科動物天然缺失輕鏈的重鏈抗體（HCAb）獲得的重鏈可變區(qū)，即單一的折疊單元，保留了完整的抗原結(jié)合活性，是最小的天然抗體片段[10]。HCAb中的這種由重鏈可變區(qū)結(jié)合抗原的單一結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的抗體稱為單域重鏈抗體（variable domain of the heavy-chain of heavy-chain antibody，V_HH）。

第二類是從鯊魚等軟骨魚中發(fā)現(xiàn)的無輕鏈或其他蛋白分子伴隨的類似于HCAb的新的或護(hù)士鯊抗原受體（IgNAR）獲得的重鏈可變區(qū)。

第三類是從人源或鼠源單克隆抗體獲得的重鏈或輕鏈的可變區(qū)，它們雖保留額抗原結(jié)合特異性，但因親和性和可溶性大為下降，實(shí)際應(yīng)用較罕見。

由于駱駝科動物比軟骨魚類更容易飼養(yǎng)和免疫，因而更常被研究人員使用。sdAb比scFv結(jié)構(gòu)更簡單，易與受體結(jié)合等優(yōu)點(diǎn)，在研發(fā)疫苗、治療藥物、診斷試劑和生物技術(shù)研究工具等方面均有較大的發(fā)展空間。

四、單克隆抗體的命名

與其他大多數(shù)藥物不同，單克隆抗體的命名基于其來源和靶物質(zhì)采用了不同的詞干。

世界衛(wèi)生組織的國際通用藥物名稱（INN）對各詞干進(jìn)行了定義。見表1.

表1.單克隆抗體詞干含義表（FromWikipedia）

參考文獻(xiàn)

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3. Mavromatis B, Cheson.BD, Monoclonal antibody therapy of chroniclymphocytic leukemia. [J].Clin Oncol.2003 May;21(9):1874-81

4. Tsurushita N, et al, Design of humanized antibodies: from anti-Tac toZenapax. Methods. 2005 May;36(1):69-83

5. Rader C,Overview on Concepts and Applications of Fab Antibody Fragments, [J].CurrentProtocols in Protein Science, 2009 Feb, 6.9.1-6.9.14

6. Carter PJ,Potent antibody therapeutics by design. [J]. Nat Rev Immunol, 2006(6):343-357

7. 劉美君等, Fab類抗體的研究進(jìn)展, [J].國際藥學(xué)研究雜志，2014, 41(3):318-324

8. Fernández LA,Prokaryotic expression of antibodies and affibodies. [J]. Current Opinion inBiotechnology, 2004, 15:364-373

9. 秦海艷等, 單鏈抗體的研究進(jìn)展, [J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2011,014(01):795-798

10. Bond CJ, James C, et al. Contributions of CDR3 to VHHDomain Stability and the Design of Monobody Scaffolds for Naive AntibodyLibraries. Journal of Molecular Biology. 2003, 332(3)

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