第二章往期回顧

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文獻(xiàn)題目：High-quality de novo assembly of the apple genome and methylome dynamics of early fruit development

發(fā)表期刊：Nature Genetics

發(fā)表時(shí)間：2017年6月8日

影響因子：27

摘要介紹：本研究由法國、意大利、南非、荷蘭、奧地利等多國科學(xué)家共同合作，完成了一個(gè)迄今為止最好的栽培蘋果品種的基因組從頭組裝。除了第二代和第三代測序數(shù)據(jù)聯(lián)合組裝外，本文還利用光學(xué)圖譜技術(shù)提升組裝效果。超過一半的基因組組裝結(jié)果中充斥著重復(fù)序列，這雖然在木本植物中十分常見，但本文進(jìn)一步在異染色質(zhì)區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的大量重復(fù)的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列，并且推測出2100萬年前發(fā)生過一次轉(zhuǎn)座因子的爆發(fā)。

而這次爆發(fā)時(shí)間與天山山脈的地質(zhì)隆起時(shí)間一致，考慮到天山山脈地區(qū)是蘋果的物種起源中心，這些轉(zhuǎn)座因子及其爆發(fā)過程可能與蘋果和梨的物種分化，及蘋果祖先的物種多樣性的形成具有較大影響。本研究另外探討了蘋果全基因組的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)了甲基化在果實(shí)發(fā)育等重要農(nóng)藝性狀上有重要意義。

研究意義：完善了2004年第一個(gè)蘋果基因組文章當(dāng)中相對(duì)較差的組裝結(jié)果；提供了一個(gè)非常完善的蘋果參考基因組；為蘋果基因組重復(fù)序列對(duì)其物種分化和祖先物種多樣性形成的研究指出了方向；對(duì)影響果實(shí)發(fā)育的幾十個(gè)基因的甲基化標(biāo)記進(jìn)行了深入研究。

研究難點(diǎn)：構(gòu)建一個(gè)具有單純遺傳背景的雙單倍體實(shí)驗(yàn)材料；完成大量的全基因組單堿基分辨率的甲基化測序并挖掘?qū)麑?shí)發(fā)育有重要影響的基因。

研究方向：

1. 蘋果De novo基因組學(xué)研究；

2. 蘋果基因組轉(zhuǎn)座子研究；

3. 蘋果轉(zhuǎn)錄組和小RNA分析；

4. 蘋果全基因組甲基化研究；

研究亮點(diǎn)：

1. 二三代聯(lián)合組裝，Bionano輔助組裝；

2. 轉(zhuǎn)座子在蘋果的物種分化與祖先多樣性形成中可能發(fā)揮重要作用；

3. 某些基因的甲基化可能對(duì)果實(shí)發(fā)育產(chǎn)生重要影響，可用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。

研究問題：

1. 雙單倍體金冠蘋果基因組組裝（二三代測序與BioNano數(shù)據(jù)聯(lián)合組裝）；

2. 重復(fù)序列尤其是轉(zhuǎn)座子的爆發(fā)與蘋果物種分化及多樣性形成的關(guān)系；

3. 蘋果全基因組甲基化水平研究及其與產(chǎn)量等重要農(nóng)藝性狀等的關(guān)聯(lián)，并可為用于栽培蘋果分子標(biāo)記輔助選擇的表觀標(biāo)記的開發(fā)提供支持。

研究對(duì)象：栽培蘋果“金冠”（Golden Delicious）的雙單倍體植株用于基因組de novo研究，

以及2株分別產(chǎn)大小兩種果實(shí)的金冠蘋果的不同組織用于全基因組甲基化研究。

所用軟件：

組裝與比對(duì)：SOAPdevo2.223，BWA－MEM，Pilon1.17，BESST，IrisViewer v2.5，DBG2OLC；

連鎖圖譜：R package snpStats和LDheatmap； 

甲基化分析：deepTools；

注釋：Trinity，SOAPdenovo-trans，EuGene，InterProScan，TargetP；

共線性分析：SynMap；

重復(fù)序列分析：REPET package TEdenovo和TEannot， 

所用數(shù)據(jù)：

1. 金冠蘋果全基因組從頭測序的二代shotgun和三代數(shù)據(jù)；

2. BioNano數(shù)據(jù)；

3. 7個(gè)栽培和雜交品種的不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；

4. 2個(gè)品種的葉片與果實(shí)的重亞硫酸氫鹽測序數(shù)據(jù)；

5. 雙單倍體金冠蘋果植株的sRNA數(shù)據(jù)；

實(shí)驗(yàn)過程：

Denovo樣品準(zhǔn)備：利用一個(gè)含有未受精卵子的子房發(fā)育形成金冠蘋果的單雙倍體植株。

轉(zhuǎn)錄組樣品準(zhǔn)備：利用7個(gè)栽培品種的根，莖，葉，莖尖，種子和花等6個(gè)部位的組織樣品提取DNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

研究成果：

1. 對(duì)金冠蘋果的雙單倍體個(gè)體（GDDH13）進(jìn)行測序，基于二三代測序數(shù)據(jù)及BioNano光學(xué)圖譜數(shù)據(jù)和一個(gè)高密度的連鎖圖譜組裝得到2150個(gè)contigs和280個(gè)scaffolds，超過50%的contigs被包含在大于620kb的contigs序列中。進(jìn)一步結(jié)合600x的光學(xué)圖譜數(shù)據(jù)，組裝后的一致性序列的長度從625Mb提高到了649Mb。利用兩種方法對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行評(píng)估：將遺傳圖譜上的15417個(gè)SNP比對(duì)到組裝的scaffold中，發(fā)現(xiàn)同源的數(shù)量達(dá)到14732個(gè)，而其中可以定位到目標(biāo)基因組位置的標(biāo)記達(dá)到95.8%，14117個(gè)；第二種方法采用SNP標(biāo)記間的r2參數(shù)來評(píng)估連鎖不平衡水平，在本版本的組裝結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)任何abrupt jumps。

2. 通過對(duì)7個(gè)品系的不同組織樣品的轉(zhuǎn)錄組測序和組裝，并進(jìn)一步比對(duì)回組裝后的基因組數(shù)據(jù)，鑒定出來42,140個(gè)編碼基因和1,965個(gè)非編碼基因，其中23.3%出現(xiàn)在組裝的基因組中。對(duì)之前發(fā)布的sRNA數(shù)據(jù)比對(duì)回基因組，發(fā)現(xiàn)大部分長度在21和22nt的sRNA都比對(duì)回了編碼基因，而大部分24nt都則比對(duì)到了TEs，而23nt的則在兩類中分布較平均。

3. 本文重點(diǎn)對(duì)重復(fù)序列中的轉(zhuǎn)座子進(jìn)行了研究。利用TEdenovo檢測流程對(duì)基因組中的TEs的拷貝進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)超過基因組57%的區(qū)域包含有轉(zhuǎn)座子。具體分布情況在下面的圖示中展示。

4. 本文對(duì)葉片和果實(shí)的全基因組單堿基甲基化水平進(jìn)行了研究，葉片中CG，CHG和CHH所占比例分別為49%，39%，12%。DNA甲基化在染色體中的分布很不均一，甲基化峰出現(xiàn)的區(qū)域集中在非重組熱點(diǎn)區(qū)。和預(yù)期一樣的是，基因序列區(qū)甲基化水平低，而TEs區(qū)是甲基化熱點(diǎn)。針對(duì)基因的甲基化狀態(tài)對(duì)基因進(jìn)行了三種分類：I類基因在CG與CHG區(qū)域尤其是其周圍區(qū)域具有高甲基化水平；II類基因在CG具有較低的甲基化水平在CHG和CHH具有極低的甲基化水平，而周圍區(qū)域相對(duì)較高；III類基因在基因區(qū)及其周邊區(qū)域甲基化水平均低。第三類基因在蘋果中占比最高（64.5%）揭示了蘋果整體甲基化水平較低。

5. 為了進(jìn)一步獲得甲基化對(duì)果實(shí)發(fā)育的影響的信息，文章對(duì)比了GDDH13葉片和果實(shí)的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)了1017個(gè)差異甲基化區(qū)域，而其中86%為CHH甲基化。在差異甲基化基因上游2kb的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)與擬南芥同源的基因，這些基因在花和果實(shí)的發(fā)育中扮演重要角色。

6. 我們商業(yè)種植的金冠蘋果為本文進(jìn)行denovo測序的GDDH13與GDDH18的雜交種。前者果實(shí)巨大，而GDDH13和18則果實(shí)體積小很多，18尤其瘦小。為了研究哪些基因的甲基化會(huì)對(duì)此產(chǎn)生影響，本文在授粉前3天、授粉后3天、授粉后9天三個(gè)時(shí)間段對(duì)GDDH13和18進(jìn)行了全基因組甲基化測序。在授粉后9天的樣本中發(fā)現(xiàn)了148個(gè)高置信度的差異甲基化基因其中53個(gè)基因的甲基化區(qū)域位于啟動(dòng)子區(qū)。最終發(fā)現(xiàn)GDDH18含有17個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域甲基化差異化低水平的基因，而其中一些基因在其它物種中也發(fā)現(xiàn)與果實(shí)大小有關(guān)。這可能揭示了GDDH13與18果實(shí)大小差異的問題。

圖1 基因組的組裝與結(jié)果驗(yàn)證

圖2  基因組與表觀基因組共線性分布圖

圖3 轉(zhuǎn)座子的分布及其進(jìn)化分析

圖4 蘋果葉片與果實(shí)中的差異甲基化區(qū)域