在接下來(lái)的時(shí)間里，我將分別介紹以下三個(gè)部分，Duchenne

Muscular Dystrophin，也就是DMD的臨床；機(jī)制，包括基因和編碼產(chǎn)物蛋白質(zhì)；然后介紹診斷策略；最后一部分是治療方案，包括最新的治療進(jìn)展

我們知道有很多病以人名字來(lái)命名，是為了紀(jì)念這位醫(yī)生。DMD就是為了紀(jì)念Duchenne醫(yī)生，他是法國(guó)人，神經(jīng)內(nèi)科的先驅(qū)，主要活躍在19世紀(jì)，發(fā)展了肌電圖，醫(yī)學(xué)照相，組織活檢等多項(xiàng)技術(shù)。大家是不是覺(jué)得，Duchenne醫(yī)生一定報(bào)道了第一個(gè)病例吧？這樣我們才紀(jì)念他。其實(shí)不是。歷史上，第一個(gè)DMD病例其實(shí)是由兩位亞洲尼泊爾醫(yī)生首先報(bào)道的。為什么這兩位醫(yī)生在醫(yī)學(xué)史上沒(méi)能夠留下他們的姓名。反而是十幾年后的Duchennne更廣為我們所知呢，第一個(gè)原因是當(dāng)時(shí)的法國(guó)是醫(yī)學(xué)，尤其是神經(jīng)內(nèi)科的研究中心，Duchenne的研究引起了更多人的關(guān)注，另一個(gè)原因是因?yàn)镈uchennne醫(yī)生進(jìn)行了非常詳細(xì)，并且直觀的報(bào)道。

這張照片就是Duchenne報(bào)道的病人，一個(gè)典型的DMD男孩。DMD是最常見(jiàn)的罕見(jiàn)病了，報(bào)道的發(fā)病率在每3000到6000個(gè)男孩中就有一個(gè)病人。一般起病年齡在2歲到6歲之間，發(fā)病之后肌力是明顯弱于同齡人，不加以治療的話，到了青春期就只能依靠輪椅來(lái)活動(dòng)了。由于肌肉細(xì)胞被不斷地破壞，CK的水平是非常高的。

對(duì)于這樣一個(gè)比較常見(jiàn)的罕見(jiàn)病，早期認(rèn)識(shí)DMD就非常重要了。如果我們?cè)陂T(mén)診遇到發(fā)育遲緩，遲遲不會(huì)走路的幾歲男孩，或者高爾征陽(yáng)性，或者步態(tài)異?；蚣×苋?，小腿肌肉異常肥大，再檢查發(fā)現(xiàn)CK水平很高，就應(yīng)該高度懷疑DMD，進(jìn)行下一步檢查。

DMD是由dystrophin基因變異導(dǎo)致的遺傳病。這個(gè)基因位于X染色體的短臂，是一個(gè)很大的基因，約有2.4 兆堿基對(duì)。每一個(gè)藍(lán)色的方格代表這一個(gè)外顯子，一共有79個(gè)外顯子。外顯子的弧線或者直線，表示著氨基酸編碼閱讀框的順序。

DMD的遺傳方式符合伴性遺傳，也就是X連鎖的隱性遺傳。一個(gè)家庭中的DMD患病男孩，我們稱之為先證者。由于女性有兩個(gè)X染色體，所以母親叫做攜帶者。而男性由于只有一個(gè)X染色體，如果這個(gè)拷貝有變異，比如這位先證者，就會(huì)發(fā)病。而如果兒子沒(méi)有從母親那里遺傳到這個(gè)有變異的X染色體，那么他就是正常的，不發(fā)病。

dystrophin這樣一個(gè)巨大的基因，編碼的產(chǎn)物也不只有一種，有長(zhǎng)有短。最長(zhǎng)產(chǎn)物的Dp427就有骨骼肌，心肌，浦肯野纖維這三種不同的轉(zhuǎn)錄本。稍微短的一些產(chǎn)物分布在其他不同的組織，例如視網(wǎng)膜，腦部。所以，這也是為什么DMD會(huì)影響心臟以及DMD患者也可能出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育問(wèn)題的生理基礎(chǔ)。更短的一些產(chǎn)物還需要我們進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

我們已經(jīng)知道Dystrophin基因是很大的一個(gè)基因，相應(yīng)的， Dystrophin蛋白也是很大的一個(gè)蛋白，有427k道爾頓。這個(gè)蛋白位于肌細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)面，一側(cè)連接在actin肌動(dòng)蛋白上，另一側(cè)連接著肌細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)復(fù)合體，通過(guò)這個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合體固定在細(xì)胞外基質(zhì)上。另一方面，dystrophin連接著細(xì)胞骨架 microtubules。在肌肉的收縮過(guò)程中，發(fā)揮穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)的作用。我們可以把Dystrophin看成穩(wěn)定船的錨繩。 DMD疾病呢，就是這個(gè)錨繩斷開(kāi)了，船無(wú)法被有效地固定起來(lái)。

接下來(lái)我們來(lái)了解一下都有哪些致病突變會(huì)導(dǎo)致錨繩斷開(kāi)。這個(gè)圖表基于eDystrophin網(wǎng)站的統(tǒng)計(jì)，我們看到，絕大部分的DMD都是由片段缺失，也就是deletion導(dǎo)致的，占到了64% ，片段重復(fù)占到了超過(guò)21%。由于片段的缺失或者重復(fù)，導(dǎo)致編碼氨基酸的編碼框的閱讀位置被改變，這樣翻譯出的多肽鏈的氨基酸順序和正常的順序完全不同，翻譯也提前終止，這樣的dystrophin蛋白就喪失了正常功能。

有些DMD是由無(wú)義突變，英文叫做nonsense導(dǎo)致的。由于這個(gè)提前出現(xiàn)的終止密碼子，dystrophin蛋白的翻譯被提前終止了，這樣的不成熟產(chǎn)物既沒(méi)有功能，也更加不穩(wěn)定，更容易被細(xì)胞降解掉。

Dystrophin蛋白缺失導(dǎo)致DMD的病理機(jī)制是一個(gè)很復(fù)雜的表格。我們還是用錨繩斷開(kāi)這個(gè)模型來(lái)幫助理解。普通人的肌肉由于有這個(gè)錨繩的固定作用，肌肉細(xì)胞能夠正常收縮，我們可以進(jìn)行正常的行走，運(yùn)動(dòng)等等。DMD病人由于這個(gè)錨繩的斷開(kāi)，普通的肌肉收縮比如呼吸、走路，對(duì)他們來(lái)說(shuō)就會(huì)導(dǎo)致肌肉損傷，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)、肌肉纖維化、反復(fù)破壞與再生等一系列的反應(yīng)，最終導(dǎo)致肌肉不具備正常的收縮功能。

如果錨繩沒(méi)有斷開(kāi)，而只是縮短了呢？這就是Becker型肌營(yíng)養(yǎng)不良。Duchenne型患者是完全缺失正常功能的Dystrophin蛋白。Becker型患者，Dystrophin蛋白一般存在部分功能的.

相對(duì)于Duchenne型，Becker型患者起病比較遲，一般是兒童期，也有到成年期才發(fā)病的，病情進(jìn)展也更加緩慢一些，20歲之后才需要依賴輪椅，當(dāng)然也有不需要依賴輪椅的。由于肌肉損傷沒(méi)有那么嚴(yán)重，CK升高一般在5倍左右。除了Duchenne，Becker這兩種影響骨骼肌的疾病之外，dystrophin還可能會(huì)僅僅影響心臟，也就是DMD相關(guān)性擴(kuò)張性心肌病

我們一般認(rèn)為女性攜帶者不發(fā)病。一項(xiàng)2016年的研究調(diào)查了15位攜帶者，8位沒(méi)有臨床癥狀，僅僅有CK升高，另外7位有輕微的癥狀，比如：肢帶肌力下降，步態(tài)異常，運(yùn)動(dòng)不耐受。也有攜帶者肌電圖有異常的。

和大家分享一下我自己的一個(gè)病例。這是個(gè)11歲女孩，沒(méi)有臨床癥狀，體檢發(fā)現(xiàn)CK升高。肌活檢提示Calpain3蛋白可疑性降低，所以他們?nèi)ミM(jìn)行了CAPN3基因測(cè)序，結(jié)果是正常的。接著父母和孩子來(lái)我們這里做全外測(cè)序分析，我們找到了一個(gè)DMD基因上的 de novo無(wú)義突變。所以最后我建議治療醫(yī)生回頭去確認(rèn)一下肌活檢，同時(shí)這個(gè)女孩長(zhǎng)大了之后如果生育男孩的話，也是有DMD的患病風(fēng)險(xiǎn)的。

在疾病的機(jī)制環(huán)節(jié)，我們了解了DMD是X染色體上的基因，dystrophin蛋白位于肌細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，發(fā)揮錨繩類似的固定作用。也了解了Duchenne型，Becker型肌營(yíng)養(yǎng)不良的不同，以及女性攜帶者。探討完了機(jī)制，接下來(lái)進(jìn)入診斷環(huán)節(jié)。我們可以在基因水平檢測(cè)，也可以在蛋白水平檢測(cè)，請(qǐng)問(wèn)各位，大家覺(jué)得哪一種方法應(yīng)該是首選呢？

這個(gè)答案其實(shí)一直都在變化。在測(cè)序普及之前，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法一直是肌肉活檢。從患者身上取一塊肌肉下來(lái)，在實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行組織固定，切片。

診斷金標(biāo)準(zhǔn)是免疫組化，進(jìn)行抗dystrophin抗體染色。我當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)室有4種不同的抗體，針對(duì)不同的結(jié)構(gòu)域都要做。左邊的是正常的肌肉切片，我們可以看到清晰的肌纖維，形態(tài)是正常成簇的。右邊的是DMD肌肉切片，dystrophin蛋白是明顯缺失的，肌纖維的形態(tài)也不是正常狀態(tài)。

隨著NGS時(shí)代的來(lái)臨，基因檢測(cè)走進(jìn)了臨床實(shí)踐。這個(gè)診斷步驟取自2010年發(fā)表的DMD診斷指南。我們看到，懷疑DMD，可以跳過(guò)肌活檢直接進(jìn)行基因檢測(cè)，基因檢測(cè)的方案呢，首先進(jìn)行片段缺失與重復(fù)的分析，陰性結(jié)果的話，進(jìn)行下一步的測(cè)序分析。如果發(fā)現(xiàn)了致病變異，診斷確定，不需要再進(jìn)行活檢了。而反之，肌活檢確定了蛋白異常，基因檢測(cè)則是必須的步驟。

隨著技術(shù)的進(jìn)步，我們實(shí)際上可以不再遵守先缺失與重復(fù)分析，再進(jìn)行基因測(cè)序的步驟。NGS測(cè)序的數(shù)據(jù)，在保證足夠的測(cè)序深度的情況下，是可以提示片段缺失的。我自己在工作中就這樣發(fā)現(xiàn)了好幾例，最終MLPA也驗(yàn)證了病人的片段缺失。MLPA方法是檢測(cè)片段缺失與重復(fù)的金標(biāo)準(zhǔn)。為什么我在這里和大家討論未來(lái)NGS與MLPA的順序互換呢？費(fèi)用Money~很多DMD的孩子，家境困難。由于國(guó)情所限，費(fèi)用問(wèn)題常常是我們醫(yī)生在臨床上需要面對(duì)的實(shí)際問(wèn)題。MLPA作為金標(biāo)準(zhǔn)，試劑是MLC Holland公司的專利產(chǎn)品，費(fèi)用不低。而NGS測(cè)序的費(fèi)用逐年下降。因此，在可以預(yù)見(jiàn)的未來(lái)幾年，我個(gè)人相信，也期望NGS測(cè)序數(shù)據(jù)能夠?yàn)樵\斷片段缺失與重復(fù)發(fā)揮更大的作用。

那么現(xiàn)在問(wèn)題來(lái)了，病人確診了DMD，應(yīng)該如何治療呢？

在談治療方案之前，我們先來(lái)關(guān)心一下費(fèi)用。2017年一篇文章的表格給我們提供了發(fā)達(dá)國(guó)家的數(shù)據(jù)。我們看到像德國(guó)，意大利，英國(guó)美國(guó)這些國(guó)家，一個(gè)病人一年的費(fèi)用都在幾萬(wàn)。這還只是直接的像藥費(fèi)，護(hù)理費(fèi)這些，不包括家庭護(hù)理的負(fù)擔(dān)。大家都是臨床醫(yī)生，根據(jù)大家經(jīng)驗(yàn)，這個(gè)病每年費(fèi)用是多少呢？希望有經(jīng)驗(yàn)的老師等會(huì)可以和我們分享一下。

具體的治療我們需要參考TREAT-NMD的指南。TREAT-NMD是歐盟支持的一個(gè)專注于神經(jīng)肌病的知識(shí)庫(kù)，提供像DMD，SMA，CMD等等病的診斷指南，家庭護(hù)理指南，研究進(jìn)展等一系列的知識(shí)。對(duì)神經(jīng)肌病有興趣的老師可以經(jīng)常關(guān)注一下這個(gè)網(wǎng)站。DMD有2010年發(fā)表的很系統(tǒng)的治療指南，可以在他們的網(wǎng)站上查看英文全文。也有一個(gè)簡(jiǎn)略版本，歸納了診治要點(diǎn) 。協(xié)和醫(yī)院的戴毅老師把它翻譯成中文。

最重要的幾點(diǎn)包括：第一，參加患者肌病組織，從組織中獲得支持和幫助。我們國(guó)內(nèi)有李衛(wèi)國(guó)老師負(fù)責(zé)的DMD關(guān)愛(ài)協(xié)會(huì)。第二，是激素治療，需要對(duì)家長(zhǎng)進(jìn)行解釋，早期應(yīng)用。第三呢，是多學(xué)科的綜合治療，包括心臟監(jiān)測(cè)，骨科骨密度，關(guān)節(jié)功能，呼吸功能，心理健康等等。這個(gè)一方面需要綜合醫(yī)院建設(shè)這樣的綜合治療門(mén)診，聚集多學(xué)科的專家，另外一方面又回到了費(fèi)用問(wèn)題，患者是否可以負(fù)擔(dān)的起。

在充分認(rèn)識(shí)了DMD的致病突變之后呢，制藥公司們也在積極開(kāi)發(fā)新治療方案 。

首先給大家介紹的是針對(duì)片段缺失，外顯子缺失的 exonskipping方案。

我們先來(lái)詳細(xì)看一下exonskipping，外顯子跳躍的治療原理。正常情況下全部外顯子是被依次翻譯的。deletion造成某個(gè)外顯子，或者幾個(gè)外顯子缺失。以49號(hào)50號(hào)外顯子缺失為例，這兩個(gè)外顯子缺失之后，編碼氨基酸的編碼框的閱讀位置被改變，這樣翻譯出的多肽鏈的氨基酸順序和正常的順序完全不同，翻譯也提前終止，蛋白產(chǎn)物就沒(méi)有了正常功能。這個(gè)Eteplirsen 是反義寡聚核苷酸，剛好有針對(duì)性的結(jié)合到51號(hào)外顯子上，把這個(gè)外顯子就屏蔽掉了，因此，直接從48號(hào)外顯子就跳到52號(hào)外顯子，氨基酸的閱讀框恢復(fù)，蛋白質(zhì)等于說(shuō)變短了一些，但是還是有部分功能。等于把Duchenne的病人變成了Becker型。

Eteplirsen是Sarepta公司開(kāi)發(fā)的一種注射藥。研究發(fā)現(xiàn)大約13%的病人是由這兩個(gè)外顯子缺失導(dǎo)致的，所以這個(gè)藥還是有一定的患者人群。在II期臨床試驗(yàn)，治療效果是很明顯的，dystrophin蛋白的表達(dá)量在72%的患者中都上升了。這個(gè)藥2016年已經(jīng)通過(guò)了FDA的審批。

我們前邊介紹無(wú)義突變，提前出現(xiàn)的終止密碼子，dystrophin蛋白的翻譯被提前終止了，這樣的不成熟產(chǎn)物既沒(méi)有功能，也更加不穩(wěn)定，更容易被細(xì)胞降解掉。一個(gè)叫Ataluren的新藥就是針對(duì)提前出現(xiàn)的終止密碼子的。

這個(gè)分子是特異性識(shí)別提前出現(xiàn)的終止密碼子，核糖體也是被屏蔽掉，所以翻譯就會(huì)繼續(xù)下去，直到正常的密碼子出現(xiàn)，翻譯終止。這樣呢，蛋白質(zhì)就能夠被重新正確地表達(dá)出來(lái)。

Ataluren的臨床試驗(yàn)是一波多折。最初沒(méi)有限制患者的年齡，所以二期臨床沒(méi)有觀察到6分鐘行走實(shí)驗(yàn)的明顯改善。經(jīng)過(guò)幾年的反復(fù)數(shù)據(jù)分析，對(duì)DMD疾病進(jìn)展更深入的觀察，他們重新設(shè)計(jì)的臨床試驗(yàn)獲得了成功。2016年這個(gè)藥在德國(guó)已經(jīng)上市，仍屬于臨床試驗(yàn)期，售價(jià)非常昂貴，一年費(fèi)用是幾百萬(wàn)歐元。但是，由于歐洲藥監(jiān)局認(rèn)定，進(jìn)入了法定醫(yī)療保險(xiǎn)的范圍，所以符合條件的患者可以使用這個(gè)藥物。條件就是基因檢測(cè)確定患者攜帶nonsense突變，并且年齡小于6歲。優(yōu)點(diǎn)是-口服給藥。

這就是我們今天的內(nèi)容。在疾病的機(jī)制環(huán)節(jié)，我們了解了DMD是X染色體上的基因，dystrophin蛋白位于肌細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，發(fā)揮錨繩類似的固定作用。也了解了Duchenne型，Becker型肌營(yíng)養(yǎng)不良的不同，以及女性攜帶者。在診斷環(huán)節(jié)，分別介紹了肌活檢和基因診斷的方法。治療部分，外顯子跳躍的藥物是針對(duì)片段缺失的，Ataluren是針對(duì)無(wú)義突變的。

非常謝謝大家的參與?，F(xiàn)在我們進(jìn)入提問(wèn)環(huán)節(jié)。各位老師以后也可以在我知乎專欄上與我互動(dòng)。