當(dāng)我們想用哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白用于結(jié)構(gòu)學(xué)研究時(shí)，首先想到的辦法是將外源基因通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染到人胚胎腎293細(xì)胞（human embryonic kidney 293 cell，HEK293）中。懸浮培養(yǎng)的HEK293能迅速及高產(chǎn)地表達(dá)外源基因，獲得大量的外源蛋白（圖1）。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作時(shí)，質(zhì)粒DNA的量需要超過(guò)1mg/L 。雖然研究者嘗試著在保持高蛋白產(chǎn)量的同時(shí)減少質(zhì)粒DNA的量，但當(dāng)需要大量培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，質(zhì)粒DNA的制備仍是一大障礙。因此，在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)就應(yīng)充分考慮這個(gè)問(wèn)題。構(gòu)建可穩(wěn)定表達(dá)外源基因的重組細(xì)胞系是可替代蛋白瞬時(shí)表達(dá)的方法，其優(yōu)勢(shì)在于大大減少了對(duì)質(zhì)粒的需求量；易于擴(kuò)大培養(yǎng)；以及可通過(guò)建立冷凍細(xì)胞庫(kù)而獲得可長(zhǎng)期使用的重組細(xì)胞系。而構(gòu)建這種重組細(xì)胞系主要的不足之處在于耗時(shí)較長(zhǎng)（圖1）。正如圖中展示的基因轉(zhuǎn)移方法，目前表達(dá)蛋白質(zhì)最佳的方法是構(gòu)建一個(gè)穩(wěn)定的細(xì)胞池，而不是構(gòu)建一個(gè)克隆細(xì)胞系（圖1）。本方法省去了單細(xì)胞克隆和細(xì)胞系篩選等步驟，這兩個(gè)步驟正是構(gòu)建細(xì)胞系中耗時(shí)最長(zhǎng)的步驟。此外，我們還對(duì)構(gòu)建細(xì)胞系和細(xì)胞池的最新進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)，并簡(jiǎn)要概述了哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法和用于基因穩(wěn)定表達(dá)的載體的設(shè)計(jì)方法。另外，有幾篇綜述介紹了已在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中通過(guò)穩(wěn)定或瞬時(shí)基因表達(dá)獲得的蛋白質(zhì)的研究信息。

圖1 懸浮培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中外源基因穩(wěn)定和瞬時(shí)表達(dá)的策略

基因瞬時(shí)表達(dá)的關(guān)鍵步驟是將一個(gè)或多個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。在后續(xù)的生產(chǎn)期（1~10天）內(nèi)細(xì)胞都懸浮于培養(yǎng)液中?；蚍€(wěn)定表達(dá)同樣需要將一個(gè)或多個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，隨后需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行為期1~2周的篩選過(guò)程。經(jīng)過(guò)篩選的重組細(xì)胞可直接構(gòu)建一個(gè)細(xì)胞池用于蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，或繼續(xù)進(jìn)行單細(xì)胞克隆構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系。在沒(méi)有選擇性壓力的情況下，可在多個(gè)克隆細(xì)胞株中篩選得到一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)產(chǎn)量高、懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)狀況好、蛋白產(chǎn)量穩(wěn)定的細(xì)胞株。可將篩選得到的某個(gè)克隆細(xì)胞系用于重組蛋白的生產(chǎn)。無(wú)論是使用轉(zhuǎn)座子、慢病毒載體或重組酶將重組基因整合到宿主基因組中，構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系和細(xì)胞池的時(shí)間是大致相同的。使用靶向整合或非靶向整合技術(shù)均可提高構(gòu)建細(xì)胞系的效率，因?yàn)檫@些方法減少了克隆細(xì)胞系的個(gè)數(shù)，減輕了篩選工作的負(fù)擔(dān)。此外，使用這些轉(zhuǎn)基因方法構(gòu)建細(xì)胞池可快速、經(jīng)濟(jì)高效地生產(chǎn)蛋白質(zhì)。 

    基因穩(wěn)定表達(dá)技術(shù)最常用的宿主細(xì)胞是可懸浮培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary cells，CHO）。主要原因包括這兩種細(xì)胞懸浮培養(yǎng)條件下細(xì)胞密度較高；易于轉(zhuǎn)染；對(duì)培養(yǎng)基要求較低，可用多種商業(yè)化的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；有糖基化缺陷型細(xì)胞株（HEK293S-GnTI^—、HEK293GlycoDelete、和CHO lec1）便于后續(xù)操作；可使用過(guò)度表達(dá)四環(huán)素抑制子（tetracycline repressor，TetR）的細(xì)胞株（T-Rex^?-293和T-Rex^TM -CHO）對(duì)外源基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；可使用特殊的細(xì)胞株（Flp-In^TM-293、Flp-In^TM、T-REx^?-293和Flp-In^TM-CHO）用于外源基因的靶向整合等。另外還有一些細(xì)胞系也可懸浮培養(yǎng)，如Hela細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（baby hamster kidney，BHK）以及人PER.C6細(xì)胞等，接下來(lái)介紹的穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建方法也可用于這些宿主細(xì)胞。

根據(jù)我們的研究經(jīng)驗(yàn)，當(dāng)目的蛋白為跨膜蛋白和分泌蛋白時(shí)，使用CHO構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系的效率較HEK293高。此外，由于CHO是大規(guī)模生產(chǎn)治療性蛋白的主要宿主細(xì)胞，因此，相關(guān)研究人員希望通過(guò)宿主工程提高蛋白的產(chǎn)量。為了優(yōu)化細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和存活率，可通過(guò)mTOR或抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-X_L的過(guò)度表達(dá)，分別獲得較高產(chǎn)量的重組抗體或細(xì)胞表面受體。靶向于蛋白分泌途徑可提高分泌蛋白的產(chǎn)量，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子YY1可在多個(gè)HEK293和CHO株中獲得較高產(chǎn)量的重組抗體。另外，過(guò)表達(dá)或抑制特定的CHO microRNAs（miRNAs）都可提高分泌蛋白的產(chǎn)量。最近有研究表明，可使用誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)基因表達(dá)的載體及可通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制多個(gè)細(xì)胞靶基因的多種短發(fā)夾RNA的組成型過(guò)表達(dá)，達(dá)到改造宿主細(xì)胞的目的。

對(duì)于HEK293和CHO細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的條件，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用的搖瓶為錐形瓶、圓形或方形的玻璃瓶，以及Nalgene的大玻璃瓶。此外，還可使用TubeSpin^? 生物反應(yīng)器。生物反應(yīng)器蓋子帶有透氣性濾膜，容量有50 mL或600 mL兩種，工作體積分別為2-20 mL和100-500 mL。最近有報(bào)道介紹了可用50 L和200 L的一次性生物反應(yīng)器進(jìn)行10-200 L的細(xì)胞培養(yǎng)^[19,20]。另外，還可選擇WAVE的一次性搖袋式生物發(fā)應(yīng)器，其培養(yǎng)體積至少為100 mL。

構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系技術(shù)最有可能出現(xiàn)的問(wèn)題是外源基因的沉默，因此細(xì)胞需要在沒(méi)有選擇性壓力的情況下培養(yǎng)數(shù)周才能表達(dá)蛋白。雖然大多數(shù)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體所采用的是人巨細(xì)胞病毒極早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子（human cytomegalovirus major immediate early promoter/enhancer，hCMV-MIE），但這并不是構(gòu)建穩(wěn)定基因表達(dá)細(xì)胞系技術(shù)的最佳選擇，因?yàn)樗谠S多細(xì)胞系（如CHO）中易受基因沉默的影響。在表達(dá)載體中加入其他元件，如核基質(zhì)相關(guān)區(qū)（matrix associated region，MAR）、泛染色質(zhì)開放元件（Ubiquitous Chromatin Opening Element，UCOE）或其它絕緣體元件，均可降低基因沉默的風(fēng)險(xiǎn)^[24]。除了hCMV-MIE以外，也可以使用小鼠巨細(xì)胞病毒極早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子（mouse cytomegalovirus major immediate early promoter/enhancer，mCMV-MIE）、人延伸因子-1α啟動(dòng)子（human elongation factor-1 alpha promoter，hEF-1α）和SV40早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子（SV40 early promoter/enhancer，SV40E）等強(qiáng)啟動(dòng)子。根據(jù)我們的研究結(jié)果，當(dāng)使用mCMV-MIE為表達(dá)載體時(shí)，轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的外源基因在CHO衍生細(xì)胞系和細(xì)胞池中均能穩(wěn)定表達(dá)。

若需在穩(wěn)定細(xì)胞系的表達(dá)載體中加入蛋白誘導(dǎo)元件，Tet-On是首選。這種方法通常僅用于細(xì)胞內(nèi)蛋白和跨膜蛋白的表達(dá)，如在多種HEK293細(xì)胞株的染色體中過(guò)表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCR）和配體門控離子通道。鑒于Tet-On的工作原理，要求宿主細(xì)胞必須穩(wěn)定并組成性表達(dá)TetR。如前文所述，目前可用的細(xì)胞系有HEK293和CHO。幾乎所有帶有Tet-On系統(tǒng)的表達(dá)載體都具有受控于hCMV-MIE的轉(zhuǎn)基因，即多個(gè)拷貝的TetR結(jié)合位點(diǎn)——Tet操縱子（Tet operator，TetO）。當(dāng)在培養(yǎng)基中加入四環(huán)素（tetracycline，Tet）或多西霉素（Doxycycline，Dox），與TetO結(jié)合的TetR被抑制，下游基因開始轉(zhuǎn)錄。正如前面所言，hCMV-MIE容易基因沉默。在這一點(diǎn)上，通過(guò)添加丁酸鈉——組蛋白脫乙酰酶抑制劑，可提高HEK293細(xì)胞中Tet-On系統(tǒng)控制下的小鼠5-HT₃受體的表達(dá)量。此外，還可以在表達(dá)載體上引入MAR或UCOE元件達(dá)到減弱基因沉默的目的。另外，還可以選擇其他的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

幾個(gè)天然存在的轉(zhuǎn)座子，包括PiggyBac（PB）、Sleepying Beauty（SB）、Tc1/mariner家族的Mos1、青鳉Tol2轉(zhuǎn)座子等，都經(jīng)改造使其可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。這些二類轉(zhuǎn)座子是由轉(zhuǎn)座酶基因和兩端的末端重復(fù)序列組成的。末端重復(fù)序列可被同源轉(zhuǎn)座酶特異性識(shí)別，而后進(jìn)行切割和連接反應(yīng)，這是轉(zhuǎn)座子從一個(gè)位置移動(dòng)到另一個(gè)位置所必經(jīng)的步驟。當(dāng)使用以上列舉的轉(zhuǎn)座子作哺乳動(dòng)物細(xì)胞的載體時(shí)，通常需要使用雙載體系統(tǒng)（圖2）。輔助載體由轉(zhuǎn)座酶和一個(gè)組成型的強(qiáng)啟動(dòng)子組成，而供載體則由末端重復(fù)序列、篩選基因以及一個(gè)或多個(gè)帶有啟動(dòng)子的外源基因組成（圖2）。適應(yīng)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)座酶有利于轉(zhuǎn)座于主動(dòng)轉(zhuǎn)錄基因中或其附近。這可能在很大程度上歸因于轉(zhuǎn)座子產(chǎn)生的細(xì)胞系的特殊生產(chǎn)力和長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

圖2  哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基于轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理圖

PB、SB、Tol2等二類轉(zhuǎn)座子通用的雙載體轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)如圖所示。輔助載體和一個(gè)或多個(gè)供載體一起共轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，其中輔助載體可瞬時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)座酶（transposase，TPase），而供載體帶有一對(duì)反向末端重復(fù)序列（inverted terminal repeats，ITRs）、一個(gè)目的基因（gene of interest，GOI）或兩個(gè)不同的帶有各自啟動(dòng)子（promoter，P）的目的基因（GOI-A和GOI-B）。每一個(gè)供載體都有一個(gè)篩選標(biāo)記（selection marker，SM）。篩選標(biāo)記通常接于一個(gè)弱啟動(dòng)子之后，與GOI進(jìn)行區(qū)分，增加篩選到高產(chǎn)重組細(xì)胞的概率。一個(gè)或多個(gè)供載體可在輔助載體的幫助下共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。瞬時(shí)表達(dá)的TPase可將來(lái)自于供載體的每個(gè)轉(zhuǎn)座子都整合到宿主細(xì)胞基因組中。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)篩選后可用于穩(wěn)定細(xì)胞池和穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建，如圖1。

PB是構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)中最為常用的轉(zhuǎn)座子，已成功在CHO、CHO lec1、HEK293和HEK293S-GnTI細(xì)胞中過(guò)表達(dá)分泌蛋白和跨膜蛋白。由于用PB系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)染能產(chǎn)生較多的重組細(xì)胞，因此也可通過(guò)PB系統(tǒng)構(gòu)建生產(chǎn)性細(xì)胞池。使用SB或Tol2都可獲得高產(chǎn)的CHO細(xì)胞系和細(xì)胞池。此外，SB和PB還被用于構(gòu)建含有Tet-On誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞系。盡管在沒(méi)有選擇壓力的情況下，PB衍生的細(xì)胞系仍具有相當(dāng)恒定的蛋白質(zhì)生產(chǎn)水平，但是在供載體上添加MAR元件可減少了基因沉默的作用。除了以上提到的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，還有一些商品化的系統(tǒng)，如Leap-In^TM（DNA 2.0，Menlo Park，CA）。有實(shí)驗(yàn)證明，使用PB系統(tǒng)可同時(shí)轉(zhuǎn)多個(gè)基因，可在穩(wěn)定的CHO和CHO lec1細(xì)胞系中表達(dá)有活性的γ-分泌酶（4個(gè)亞單位），也可在穩(wěn)定HEK293細(xì)胞系中表達(dá)電壓門控鈉離子通道（3個(gè)亞單位）。在這些例子中，均同時(shí)用兩個(gè)供載體共轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，每個(gè)載體均帶有各自的篩選標(biāo)記以及一個(gè)或兩個(gè)外源基因。

與轉(zhuǎn)座子類似，慢病毒載體傾向于把外源基因整合到轉(zhuǎn)錄活性較高的基因中。另外，通過(guò)改變感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）可在一定程度上調(diào)節(jié)每個(gè)細(xì)胞中整合載體DNA的數(shù)量。慢病毒載體的一些不足之處限制了它在蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)上的應(yīng)用。首先，構(gòu)建載體除了需要較長(zhǎng)的時(shí)間以外，還需要在二級(jí)生物安全環(huán)境中構(gòu)建和進(jìn)行宿主細(xì)胞的感染。此外，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的病毒基因組在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中容易出現(xiàn)基因突變。即使慢病毒載體在誘導(dǎo)型和組成型啟動(dòng)子的控制下，在CHO、BHK和HEK293細(xì)胞系中均可進(jìn)行高效的蛋白質(zhì)表達(dá)，但基于以上原因，慢病毒載體并不被重用。大多數(shù)情況下，外源基因受控于hCMV-MIE或一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的強(qiáng)啟動(dòng)子。但是，在一個(gè)足夠高的感染復(fù)數(shù)條件下，慢病毒載體可感染培養(yǎng)液中幾乎所有的細(xì)胞并在細(xì)胞中進(jìn)行整合，因此，這種轉(zhuǎn)基因方式也是構(gòu)建細(xì)胞池的理想方法之一。 

靶向基因整合主要方法是使用酵母Flp重組酶或噬菌體Cre重組酶進(jìn)行重組酶介導(dǎo)的盒式交換（recombinase-mediated cassette exchange，RMCE）。使用以上兩種酶進(jìn)行重組時(shí)，宿主細(xì)胞需分別用一對(duì)Flp-重組酶標(biāo)記序列（Flp-recombinase target，F(xiàn)RT）或lopxP位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，此外還需要使用一個(gè)報(bào)告基因?qū)χ亟M細(xì)胞進(jìn)行“報(bào)告”（圖3a）。隨后將可瞬時(shí)表達(dá)重組酶的載體和攜帶有外源基因及第二個(gè)報(bào)告基因的載體共轉(zhuǎn)染到已標(biāo)記好的細(xì)胞系中，進(jìn)行RMCE（圖3a）。這個(gè)系統(tǒng)可以保證獲得的重組細(xì)胞系基因組中只有一個(gè)外源基因的拷貝，且整合到轉(zhuǎn)錄活動(dòng)較為活躍的位點(diǎn)。最近，有研究在克隆CHO細(xì)胞系中通過(guò)RMCE技術(shù)過(guò)量表達(dá)了幾種不同的抗體和GPCR。還可在進(jìn)行共轉(zhuǎn)染和宿主細(xì)胞的篩選后，通過(guò)RMCE技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定的細(xì)胞池。

基于Flp的靶向整合技術(shù)稱為重組酶介導(dǎo)的DNA插入（recombinase-mediated DNA insertion，RMDI），可與市售的FLP-In^TM細(xì)胞配合使用。這種宿主細(xì)胞基因中帶有一個(gè)FRT位點(diǎn)和報(bào)告基因（圖3b）。RMCE技術(shù)要求DNA序列位于載體兩個(gè)FRT位點(diǎn)之間，才能整合到靶位點(diǎn)（圖3a），而與RMCE不同，RMDI技術(shù)可將整個(gè)質(zhì)粒整合到靶位點(diǎn)（圖3b）?？紤]到細(xì)菌DNA序列中GC含量較高，細(xì)菌DNA元件易受DNA甲基化影響而在RMDI操作中出現(xiàn)問(wèn)題。最近，有研究通過(guò)RMDI技術(shù)在Flp-In^TM-293細(xì)胞中系成功地過(guò)表達(dá)核孔復(fù)合物亞基，以及在Flp-In^TM-CHO細(xì)胞中表達(dá)P2Y₁₂受體。

已有研究構(gòu)建了具有兩個(gè)不同重組位點(diǎn)（雙重RMCE）的宿主細(xì)胞，用于在單個(gè)細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)多個(gè)外源基因。通過(guò)Flp重組酶將這一策略用于N1H3T3細(xì)胞和CHO lec3.2.8.1細(xì)胞中，或通過(guò)兩種噬菌體重組整合酶的使用用于CHO細(xì)胞。這種方法可通過(guò)單次轉(zhuǎn)染或兩次連續(xù)轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生過(guò)表達(dá)多個(gè)外源基因的穩(wěn)定細(xì)胞系。

此外，使用CRISPR/Cas9 RNA介導(dǎo)核酸酶進(jìn)行外源基因的靶向整合，可用于表達(dá)重組蛋白的穩(wěn)定CHO和HEK293細(xì)胞系的構(gòu)建。盡管這種技術(shù)只能用過(guò)表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證，但是在某種意義上它不需要對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，因而簡(jiǎn)化了基因靶向整合的過(guò)程。還有一些研究使用CRISPR/Cas9和鋅指核酸酶來(lái)構(gòu)建可研究糖基化途徑的CHO細(xì)胞。

圖3  使用Flp重組酶進(jìn)行重組酶介導(dǎo)的盒式交換和DNA插入技術(shù)進(jìn)行靶向整合的原理圖

（a）對(duì)于RMCE，需要將可瞬時(shí)表達(dá)Flp重組酶的載體和攜帶有GOI的載體共轉(zhuǎn)染到標(biāo)記的宿主細(xì)胞中，通過(guò)一對(duì)FRT/FRT’進(jìn)行盒式交換。載體還帶有一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)ATG密碼子用于與宿主基因組標(biāo)記位點(diǎn)處的缺失型B報(bào)告基因（△reporter B）融合表達(dá)。RMCE技術(shù)前后整合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)如圖所示。（b）對(duì)于RMDI，將可瞬時(shí)表達(dá)Flp重組酶的載體和攜帶有GOI、單一FRT序列和一個(gè)沒(méi)有啟動(dòng)子的報(bào)告基因的載體共轉(zhuǎn)染到標(biāo)記的宿主細(xì)胞中。RMDI技術(shù)前后整合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)如圖所示。要注意的是，RMDI前，A報(bào)告基因處于失活狀態(tài)，只有在整合后才能受啟動(dòng)子的調(diào)控。

十九世紀(jì)八十年代中期，自從重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞系第一次被報(bào)道，細(xì)胞系的構(gòu)建得到廣泛的發(fā)展。如本文所介紹的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，細(xì)胞系的構(gòu)建不再依賴于外源基因非同源重組整合到宿主基因組中。現(xiàn)今，可利用轉(zhuǎn)座酶、整合酶和重組酶等，大大地提高了構(gòu)建細(xì)胞系的效率。當(dāng)需要用穩(wěn)定細(xì)胞系或細(xì)胞池進(jìn)行生產(chǎn)時(shí)，轉(zhuǎn)基因的方法的選擇主要取決于是需要單拷貝外源基因重組到特定位點(diǎn)的細(xì)胞系，還是整合了多個(gè)、非靶向外源基因的細(xì)胞系。將來(lái)，CRISPR/Cas9將會(huì)是靶向基因整合構(gòu)建細(xì)胞系的有效方法之一。本文所描述的轉(zhuǎn)基因方法可有效構(gòu)建生產(chǎn)性重組細(xì)胞系，此外，還可用于細(xì)胞池的快速構(gòu)建。細(xì)胞池是除了穩(wěn)定細(xì)胞系和瞬時(shí)基因表達(dá)以外的蛋白質(zhì)表達(dá)手段。未來(lái)幾年，對(duì)重組蛋白生產(chǎn)的主要宿主細(xì)胞進(jìn)行基因組學(xué)和代謝組學(xué)的研究，有望在宿主細(xì)胞工程方面取得快速進(jìn)展，使得我們獲得更可行、更高效的重組細(xì)胞系和細(xì)胞池。由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞固有的遺傳和表觀遺傳不穩(wěn)定性，導(dǎo)致培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體存在異質(zhì)性，這也是未來(lái)我們需要努力克服的主要障礙。