本文轉(zhuǎn)載自“生物通”。

基因編輯對生物醫(yī)學(xué)研究的影響不亞于30年前的PCR。近年來，鋅指核酸酶（ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子（TALEN）和規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)（CRISPR）已經(jīng)掀起了一浪又一浪的基因編輯高潮。

從時間上看，ZFN是最早的，接著是TALEN，最后是CRISPR。每一次成功的交替，都伴隨著操作更簡便、應(yīng)用更普及。CRISPR的出現(xiàn)，大大簡化了基因編輯的操作，因此被研究人員廣泛采用。

盡管如此，ZFN和TALEN仍被人們認(rèn)為在基因治療中前途光明，因為它們比CRISPR更加精確。Schaefer等人近期在《Nature Methods》上發(fā)表文章，通過深度測序揭開CRISPR的脫靶效應(yīng)。作者指出：“我們發(fā)現(xiàn)了大量意想不到的單核苷酸變異，而不是像人們普遍認(rèn)為的那樣，CRISPR主要在與sgRNA同源的區(qū)域產(chǎn)生插入缺失?！?/p>

“CRISPR的簡便讓基因組編輯迅速普及，改變了疾病研究的面貌，”MilliporeSigma的基因編輯負(fù)責(zé)人Martha S. Rook博士談道?！叭欢?，對于那些需要知識產(chǎn)權(quán)專利的關(guān)鍵研究，成熟的基因編輯技術(shù)（如ZFN和TALEN）仍然是首選方法?！?/p>

重回ZFN？

CRISPR是依賴基因靶向的向?qū)NA來結(jié)合特定的序列，而ZFN則不同，它是由蛋白構(gòu)成的。這些結(jié)構(gòu)域蛋白經(jīng)過優(yōu)化，可提高精確度和特異性，適合臨床基因編輯。

據(jù)Sangamo的副總裁Michael Holmes博士介紹，ZFN需要的蛋白改造知識比CRISPR要多?！斑@也就是為什么研究人員在考慮基因編輯時，第一時間想到CRISPR，但對于治療而言，最簡單的也許并不是最好的?！?/p>

2015年12月，美國FDA批準(zhǔn)了Sangamo的B型血友病治療方案（SB-FIX）。這種方案是在患者肝臟細(xì)胞的白蛋白基因位點中插入治療基因?！爱?dāng)我們將治療基因插入這個非常強(qiáng)大的啟動子時，我們能夠?qū)⒏闻K作為蛋白生產(chǎn)工廠，這樣只需要編輯少量肝細(xì)胞就能產(chǎn)生治療水平的蛋白，”Holmes說。

這種經(jīng)過優(yōu)化的ZFN有著出色的特異性，且脫靶修飾的水平低于深度測序的檢測極限?！霸诨蚪M指定的位點獲得80%以上的編輯效率，且脫靶效應(yīng)低于檢測限，這種能力正是治療性的基因編輯所需要的，”Holmes補充說。

Sangamo的鋅指平臺對基因組所做的修飾在遺傳上是穩(wěn)定的。試劑的作用是瞬時的，但它們賦予的性狀卻是永久的?！疤烊坏倪M(jìn)化動力當(dāng)然存在，這會導(dǎo)致細(xì)胞在許多代后不分裂，或丟失染色體。不過，它與未經(jīng)過編輯的基因組相比既沒有增加，也沒有減少，”Holmes解釋說。

Proxy-CRISPR

當(dāng)然，CRISPR在許多應(yīng)用上還是具有獨特的優(yōu)勢。Rook認(rèn)為，CRISPR設(shè)計簡單，讓研究人員能輕松獲得現(xiàn)成的CRISPR全基因組文庫。此外，與ZFN和TALEN相比，它的切割效率提高，也增加了其在全基因組篩選和單個靶點編輯中的應(yīng)用。

MilliporeSigma最近宣布對CRISPR進(jìn)行改進(jìn)，以便讓這個工具更加高效、靈活和特異。他們將利用Proxy-CRISPR來接近那些之前無法觸及的基因組區(qū)域，從而加速藥物開發(fā)和基因治療。這種方法最近表達(dá)在《Nature Communications》雜志上。

Proxy-CRISPR利用CRISPR的兩次結(jié)合來實現(xiàn)高效切割。第一次結(jié)合是利用缺乏DNA核酸內(nèi)切酶活性的Cas9；第二次是通過同樣無法單獨切割人類DNA的CRISPR系統(tǒng)。據(jù)Rook介紹，這種策略是模擬天然存在的現(xiàn)象，因為許多不同的CRISPR系統(tǒng)與不同的DNA序列結(jié)合。

Proxy-CRISPR允許DNA靶點是多樣化的，就好像許多個體的致病位點都有所不同。“為了糾正各種可能的致病突變，這就需要編輯技術(shù)能夠靶定幾乎所有的DNA序列，”Rook談道?！癙roxy-CRISPR方法為使用各種CRISPR變體打開了大門，它們能夠揭開基因組差異的意義?！?/p>

靈活應(yīng)用

Poseida Therapeutics也發(fā)現(xiàn)，CRISPR技術(shù)的改進(jìn)能夠克服脫靶效應(yīng)。這家公司最近發(fā)布了臨床前數(shù)據(jù)，表明它家的高保真基因組編輯系統(tǒng)NextGEN? CRISPR可以產(chǎn)生“萬能供血者”嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）。大家都知道，這是癌癥免疫治療的重要平臺。

Poseida目前已經(jīng)積累了多個基因編輯平臺。除了NextGEN CRISPR，Poseida還采用piggyBac? DNA修飾系統(tǒng)、XTN? TALEN位點特異核酸酶以及Footprint-Free?基因編輯。

“對于不同類型的細(xì)胞而言，沒有一種永遠(yuǎn)無敵的技術(shù)，具體要取決于你想做什么，”Poseida的CEO Eric Ostertag說。“CRISPR試劑設(shè)計起來更簡單、更快速，比TALEN也略為便宜。但是，如果你有TALEN的經(jīng)驗，并且打算上臨床，那么成本和設(shè)計上的差異幾乎可以忽略不計。”

NextGEN CRISPR的優(yōu)勢在于它可以應(yīng)用在活化和靜息的T細(xì)胞，這與很多只作用在活化細(xì)胞上的技術(shù)相比就具有更大的靈活性。Ostertag表示：“干性表型對產(chǎn)品效果和持續(xù)時間都是至關(guān)重要的，因此我們傾向于改造靜息細(xì)胞?！盢extGEN CRISPR在靜息T細(xì)胞上效果很好，但TALEN不行。

野生型的CRISPR利用Cas9蛋白和向?qū)NA來切割DNA。作為天然的核糖核蛋白，它的切割效率很高，但非常馬虎，帶來一些不想要的脫靶突變。Poseida的NextGEN CRISPR則使用了類似鋅指和TALEN的核酸酶，需要兩部分同時存在才能切割，從而保證了on-target的特異性。

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