2017年5月30日發(fā)表于 Nature Methods 的一篇論文指出 CRISPR-Cas9基因編輯技術導致數(shù)百種意料之外的脫靶突變，為該技術用于人類基因治療蒙上了一層陰影。

本文經(jīng)授權轉(zhuǎn)載自公眾號“BioArt”（ID: biogossip）

CRISPR-Cas9 基因編輯技術以其簡易、高效和多樣化的特點，目前正被廣泛應用于各類模式生物中的基因功能研究，其中最受矚目的當屬將該技術應用于人類疾病的相關基因治療之中。特別值得一提的是，來自四川大學華西醫(yī)院腫瘤學家盧鈾教授及其研究小組進行，率先在全球范圍內(nèi)開展首個 CRISPR-Cas9 基因編輯臨床試驗治療肺癌，一時引起轟動，引發(fā)了國內(nèi)外各大媒體的廣泛關注。去年11月15日，Nature 雜志還以“CRISPR gene-editing tested in a person for the first time”為題作了相關報道。

盧鈾教授。圖片來源于網(wǎng)絡

然而，Nature Methods 雜志于當?shù)貢r間5月30日剛剛發(fā)表了一項來自美國哥倫比亞大學醫(yī)學中心（Columbia University Medical Center）關于“CRISPR-Cas9技術可引發(fā)基因組上發(fā)生數(shù)百個意想不到的的基因突變”的研究論文。

該論文的重要作者之一 Stephen Tsang（哥倫比亞大學醫(yī)學中心/人類營養(yǎng)研究所眼科學、病理和細胞生物學副教授）對媒體表示，“我們認為科學共同體所考慮到的 CRISPR 脫靶效應導致的基因突變所產(chǎn)生的潛在危害是至關重要的，這些突變包括單核苷酸突變以及基因組非編碼區(qū)產(chǎn)生的突變”。

Stephen Tsang 博士

CRISPR-Cas9 基因編輯技術從誕生之日起，關于該技術潛在的脫靶效應一直是個受人關注的話題，盡管此前也有不少課題組努力改進該項技術盡可能地減少其脫靶效率，但是似乎脫靶是難免的。針對 CRISPR-Cas9 的脫靶效應，目前科學家也開發(fā)了許多算法用于尋找可能的脫靶位點。

圖片來自網(wǎng)絡

在這項研究中，研究人員對課題組此前獲得的進行過 CRISPR 基因編輯的小鼠進行了全基因組測序，旨在尋找所有的 CRISPR 引發(fā)的基因突變，包括那些單堿基突變。

研究人員在確認了兩只小鼠體內(nèi)已經(jīng)用 CRISPR 技術成功修復了導致小鼠失明的基因之后，通過全基因組測序后發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)有超過1500個單核苷酸發(fā)生突變，并且有100個以上的位點發(fā)生發(fā)生了大片段的缺失和插入。值得一提的是，上述這些突變無一通過計算機設置的算法預測到。

Nature Method 論文中的部分關鍵實驗結(jié)果統(tǒng)計，圖中表示的是兩只小鼠中的突變情況統(tǒng)計。

Stephen Tsang 博士進一步表示道，“研究人員一般并不會使用全基因組測序手段去檢測脫靶效應導致的基因突變位點，并且可能忽視了潛在的重要突變位點，因為即便是單堿基突變也有可能造成較大的影響。并且希望他們的研究能夠鼓勵其它相關研究人員也使用全基因組測序技術去檢測使用 CRISPR 技術所致的突變位點，帶動研究人員開發(fā)出更加安全和精準的基因編輯技術”。

這篇 Correspondence 較為簡短，也有學者質(zhì)疑實驗對照設計不足、所使用的 sgRNA 也并非最佳版本。我們將繼續(xù)跟進該論文引起的爭議和評論。

參考資料：

1、https://www./pub_releases/2017-05/cumc-cge052617.php

2、http://www./genetics/crispr-cas9-mutations-04903.html

3、http:///crispr-gene-editing-causes-mutations/49762/

4、https:///news/2017-05-crispr-gene-hundreds-unintended-mutations.html

論文信息

標題 Unexpected mutations after CRISPR–Cas9 editing in vivo

期刊  Nature Methods

日期 May 30, 2017.

摘要  CRISPR–Cas9 editing shows promise for correctingdisease-causing mutations. For example, in a recent study weused CRISPR-Cas9 for sight restoration in blind rd1 mice by correctinga mutation in the Pde6b gene. However, concerns persistregarding secondary mutations in regions not targeted by thesingle guide RNA (sgRNA). Algorithms generate likely off-targetsites for a given gRNA, but these algorithms may miss mutations.Whole-genome sequencing (WGS) has been used to assess thepresence of small insertions and deletions (indels) but not toprobe for single-nucleotide variants (SNVs) in a whole organism.We performed WGS on a CRISPR–Cas9-edited mouse toidentify all off-target mutations and found an unexpectedly highnumber of SNVs compared with the widely accepted assumptionthat CRISPR causes mostly indels at regions homologous to thesgRNA. 

鏈接 https://www./nmeth/journal/v14/n6/full/nmeth.4293.html

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