脊髓性肌萎縮癥（Spinal Muscular Atrophy, SMA）是一種常染色體隱性遺傳的神經(jīng)肌肉病, 臨床特征是脊髓前角細(xì)胞變性退化、導(dǎo)致對(duì)稱性肌無(wú)力和肌萎縮，為一種常見的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病，主要表現(xiàn)為肌肉萎縮、肌張力低、腱反射減弱、病理征陰性，目前尚無(wú)有效治療手段。

      SMA通常根據(jù)疾病嚴(yán)重程度與發(fā)病年齡分為三個(gè)亞型。 I型患者（MIM＃253300）在出生時(shí)或在6個(gè)月之前開始發(fā)病，不能獨(dú)自坐或走，并且通常在兩年內(nèi)死于呼吸功能不全。II型患者(MIM# 253550)在6個(gè)月之后發(fā)病，可以獨(dú)坐但在沒有任何輔助設(shè)備幫助的情況下不能走路，并且壽命會(huì)大大減少，III型患者（MIM# 253400)通常在1歲半后發(fā)病，可以獨(dú)立的坐或走路，但在青春期或成人后一般行走能力有所退步，需要靠輪椅行動(dòng)。

脊髓性肌萎縮癥在人群中的攜帶率約為1/35-1/50左右，發(fā)病率約為1/6000-1/10000左右。

       目前遺傳學(xué)已經(jīng)確認(rèn)，SMA主要與兩個(gè)高度同源（是指這兩個(gè)基因的序列非常相似）的基因密切相關(guān)，SMN1與SMN2，這兩個(gè)基因主要通過7號(hào)外顯子和8號(hào)外顯子上的兩個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行區(qū)分（下圖來(lái)自Qu YJ et al, PMID: 27425821, J Mol Diagn,2016）。

一般來(lái)說(shuō)，大部分正常個(gè)體都有2份拷貝的SMN1基因與2份拷貝的SMN2基因， SMN2基因發(fā)生外顯子7的跳躍，只有少量的全長(zhǎng)SMN mRNA，所以如果某個(gè)人兩份拷貝的SMN1基因都失去功能的話一定會(huì)患病，只有一份SMN1基因起作用的個(gè)體為攜帶者。在SMN1基因都失去功能的情況下，SMN2基因拷貝數(shù)數(shù)目，則會(huì)影響患者的發(fā)病時(shí)間與疾病嚴(yán)重程度。根據(jù)Feldk?tter et al. (Am J of Hum Genetics, 2002)描述，80%的I型SMA患者攜帶有1到2個(gè)SMN2拷貝，82%的II型SMA患者攜帶有3個(gè)SMN2拷貝，96%的III型SMA患者攜帶有3或4個(gè)SMN2拷貝。所以對(duì)于SMA患者來(lái)說(shuō)，檢測(cè)SMN2基因的拷貝數(shù)在一定程度上有助于評(píng)估疾病的嚴(yán)重性或預(yù)后。等等，你們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)以上內(nèi)容有問題了，怎么會(huì)有4個(gè)SMN2拷貝呢？為了便于大家理解，上面提到大部分正常人的2份SMN2拷貝，由于基因所在區(qū)域的復(fù)雜性，實(shí)際上人群中SMN2拷貝數(shù)在0到4個(gè)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)95%以上的SMA患者都會(huì)檢測(cè)到SMN1基因外顯子7和（或）外顯子8純合缺失，除此之外，還有復(fù)合雜合突變（一個(gè)等位基因缺失，另一個(gè)點(diǎn)突變）。

      當(dāng)你理解了以上內(nèi)容后，還有一些比較復(fù)雜的情況，首先SMN1基因外顯子7的那個(gè)獨(dú)特堿基（c. 840C）可以由C轉(zhuǎn)換為T，這樣SMN1基因就變成了SMN2基因，從造成的結(jié)果上來(lái)說(shuō)，這個(gè)轉(zhuǎn)換與缺失的效果是一樣的，但是對(duì)于患者來(lái)說(shuō)就多了一個(gè)SMN2拷貝，其次，人群中有很低比例的正常人一條染色體上有2個(gè)SMN1拷貝，而另外一條染色體上為0個(gè)拷貝，這樣的正常人SMN1基因型為2+0，其實(shí)也是攜帶者，但是目前沒有切實(shí)可行的方法去區(qū)分1+1還是2+0，但是有一個(gè)位點(diǎn)與之高度關(guān)聯(lián)，也許將來(lái)三代測(cè)序可以。當(dāng)你了解了以上內(nèi)容后，我們?cè)賮?lái)聊聊SMA基因檢測(cè)，理想的基因檢測(cè)應(yīng)該達(dá)到如下效果：

1 明確區(qū)分患者、攜帶者、正常人；

2 如果為SMN1純合缺失患者，能夠檢測(cè)SMN2拷貝數(shù)；

3 除了檢測(cè)SMN1外顯子7缺失或轉(zhuǎn)換外，還能檢測(cè)點(diǎn)突變；

4 可以識(shí)別SMN12+0基因型的特殊攜帶者；

SMA基因檢測(cè)的方法有以下幾類

    首先對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過限制性內(nèi)切酶或一代測(cè)序的方法來(lái)區(qū)分，如果是患者的樣本，在c.840位點(diǎn)缺失SMN1的C峰，只顯示SMN2的T純合峰，正常人或攜帶者應(yīng)該為雜合的C/T峰圖，RFLP的分析方法性價(jià)比并不高，是那時(shí)唯一可以采用的新方法，替代SSCP分析。這個(gè)方法有個(gè)缺陷，就是有酶切不徹底的隱患，但是不能區(qū)分?jǐn)y帶者與正常人，也不能檢測(cè)SMN2拷貝數(shù)，在臨床上可以診斷SMN1純合缺失的患者，其他情況只能作為初篩。

      該方法是由黃尚志老師帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)開發(fā)，利用 SMN1與 SMN2基因中外顯子7與內(nèi)含子7的 2 處核苷酸差別, 分別設(shè)計(jì) 2個(gè)等位基因特異的引物，與內(nèi)對(duì)照直接 在瓊脂糖電泳及 PAGE進(jìn)行分析, 獲得很好的效果。 由于設(shè)計(jì)的引物正反向均有與 SMN1 基因特異堿基結(jié)合的位點(diǎn) ,應(yīng)用兩個(gè)引物對(duì)模板的選擇性, 增強(qiáng)了特異性。與酶切方法比較, 診斷結(jié)果完全一致, 但沒有非特異擴(kuò)增,避免了酶切不完全的缺點(diǎn) ,且方法簡(jiǎn)便, 易操作,適宜臨床使用。

（圖片來(lái)自黃尚志等，醫(yī)學(xué)研究雜志 2009）

     主要原理是通過兩個(gè)多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，以單拷貝RPP40基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)基因，采用MGB-Taqman探針法分別對(duì)SMN1基因第7和第8外顯子進(jìn)行拷貝數(shù)相對(duì)定量，來(lái)判斷是否發(fā)生缺失或轉(zhuǎn)換。

（圖來(lái)自上海五色石醫(yī)學(xué)研究股份有限公司官網(wǎng)）

優(yōu)勢(shì)是可以區(qū)分患者，攜帶者、正常人，其他如SMN1點(diǎn)突變和2+0基因型攜帶者也不能檢測(cè)?；颊叩腟MN2拷貝數(shù)需要另外設(shè)計(jì)探針進(jìn)行檢測(cè)。

    多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification ,MLPA）于2002年由Schouten等首先報(bào)道，是早年幾年發(fā)展起來(lái)的一種針對(duì)待檢DNA序列進(jìn)行定性和半定量分析的新技術(shù)。該技術(shù)高效、特異，在一次反應(yīng)中可以檢測(cè)45個(gè)核苷酸序列拷貝數(shù)的改變，針對(duì)c.840C>T位點(diǎn)設(shè)計(jì)不同的探針序列，SMN1基因擴(kuò)增子和SMN2基因擴(kuò)增子可以擴(kuò)增出不同的片段長(zhǎng)度，而峰的高度可以反映拷貝數(shù)變異。

（圖片來(lái)自Genetics in Med 2007:9(4)241-248）

MLPA技術(shù)除明確區(qū)分患者、攜帶者及正常人，同時(shí)檢測(cè)患者的SMN2拷貝數(shù)，。目前臨床上MLPA是SMA基因檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)，但是該試劑盒不能檢測(cè)點(diǎn)突變與特殊的SMN1 2+0攜帶者。

     DHPLC是一種基因突變篩查技術(shù)，既能夠自動(dòng)化、高通量進(jìn)行，且除PCR之外，勿需進(jìn)行PCR引物修飾、購(gòu)買特殊試劑、檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)或作其它的樣品處理。DHPLC具有高通量檢測(cè)、自動(dòng)化程度高、靈敏度和特異性較高、檢測(cè)DNA片段和長(zhǎng)度變動(dòng)范圍廣、相對(duì)價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)。蘇一寧等（pmid：15832310）通過針對(duì)c.840C>T位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增SMN基因片段，結(jié)合峰高與內(nèi)參基因來(lái)確定SMN1與SMN2拷貝數(shù)。

（圖片來(lái)自蘇一寧等，pmid：15832310）

PCR-DHPLC與MLPA類似可以明確區(qū)分患者、攜帶者及正常人，也可以檢測(cè)患者的SMN2拷貝數(shù)。

       最近貝勒醫(yī)學(xué)院的研究者在Genetics in Medicine雜志上發(fā)表了一項(xiàng)利用二代測(cè)序檢測(cè)SMA的研究（pmid：28125085），該研究包括6648例樣本。主要的原理是統(tǒng)計(jì)SMN1與SMN2總拷貝數(shù)，然后根據(jù)c.840C>T分析SMN1 reads與SMN2 reads比例，最后得出每個(gè)人分別攜帶幾個(gè)拷貝的SMN1與SMN2。與MLPA相比，靈敏度大于98%，特異性大于98%。另外該研究還確診了幾個(gè)致病點(diǎn)突變位點(diǎn)，并且g.27134T>G與RFLP結(jié)果一致，該位點(diǎn)與SMN1 2+0型特殊攜帶者密切相關(guān)。但是對(duì)于SMN2拷貝數(shù)的靈敏度與特異性未明確描述，可能是因?yàn)樵撗芯康哪康闹饕呛Y查，而非臨床診斷。

(圖片來(lái)自Feng Y et al，Genet Med. 2017)

臨床上，很多肌肉疾病和SMA的表型容易混淆，難以鑒別，傳統(tǒng)的MLPA等檢測(cè)方法僅能定向檢測(cè)SMA，而全外顯子測(cè)序這類NGS技術(shù)不僅可以定向檢出SMA，還可以同時(shí)覆蓋其他相關(guān)表型的類似肌病，這是一個(gè)優(yōu)勢(shì)，當(dāng)然NGS技術(shù)目前尚不能說(shuō)是完美， NGS可以作為初篩診斷SMA和其他肌病的有效方法，但初篩疑似陽(yáng)性的結(jié)果還需要進(jìn)行MLPA或Sanger測(cè)序的驗(yàn)證。另外在SMN2拷貝數(shù)分析方面，NGS還有待更多的證據(jù)證明其準(zhǔn)確性和可靠性。

     本文整理了SMA相關(guān)資料與各基因檢測(cè)平臺(tái)的比較，隨著測(cè)序成本的下降，通過全外顯子或大Panel進(jìn)行遺傳病篩查與診斷已經(jīng)成為趨勢(shì)，而對(duì)于大片段缺失重復(fù)的疾病如果能夠通過算法優(yōu)化檢測(cè)將讓NGS性價(jià)比更高，在臨床上，對(duì)于SMA患者，還需要MLPA驗(yàn)證及確定SMN2拷貝數(shù)。

本文在撰寫過程中得到黃尚志老師、首都兒科研究所宋昉教授、上海兒童醫(yī)學(xué)中心王劍主任、北京智因東方谷為岳老師的幫助，在此表示衷心的感謝！