有很多人提到科研，都很苦惱，不知道從何處下手，尤其是設(shè)計(jì)科研思路。其實(shí)突破就在看文獻(xiàn)?？梢哉f，如果你科研遇到問題了，沒有別的辦法，就是看文獻(xiàn)。

今天我們就和大家來分析一篇文獻(xiàn)，幫大家梳理一下如何從文獻(xiàn)中尋找科研思路。

經(jīng)典藥物在 Nature 上華麗麗登場(chǎng)，幕后推手是誰呢？看過以后，你會(huì)發(fā)現(xiàn)你所熟悉的分生實(shí)驗(yàn)都太 low 了。該研究適合領(lǐng)域：免疫學(xué)、藥理學(xué)、內(nèi)科學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、化學(xué)生物學(xué)、藥學(xué)。

Th17 細(xì)胞分化可能是很多自身免疫性疾病的基礎(chǔ)。作者的研究工作圍繞 Th17 免疫細(xì)胞的分化展開。他們選的研究靶點(diǎn)是孤兒核受體 RORγt。選擇靶點(diǎn)的思路可能有：

1. RORγt 是一個(gè)三年前剛被證實(shí)和 Th17 免疫細(xì)胞分化密切相關(guān)的新靶點(diǎn)，夠新穎；

   
   

2. 作為一種轉(zhuǎn)錄因子，其藥物篩選有現(xiàn)成的自動(dòng)化程度高的實(shí)驗(yàn)技術(shù)：熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)；

   
   

3. RORγt 的內(nèi)源性配體（膽固醇的代謝產(chǎn)物）在一年前剛被發(fā)現(xiàn)，這使得通過激活熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)來反映 RORγt 的轉(zhuǎn)錄活性變得非常容易，只需改變培養(yǎng)基中膽固醇含量即可。
   

隨后作者用基因工程技術(shù)在 S2 細(xì)胞株中建立了針對(duì) RORγt 核受體完整的報(bào)告基因篩選系統(tǒng)。通過定點(diǎn)突變和改變培養(yǎng)基中膽固醇水平，都能驗(yàn)證該細(xì)胞株的熒光素酶信號(hào)可直接反映 RORγt 受體的核轉(zhuǎn)錄活性。

而后，作者用這個(gè)系統(tǒng)開始篩選藥物，從 4 000 多個(gè)化合物中篩選出地高辛及其衍生物是很強(qiáng)的 RORγt 受體抑制劑。作者通過一系列高大上的工作，證實(shí)地高辛對(duì) RORγt 的作用又靠譜又純潔。

比如：通過熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，證實(shí)地高辛對(duì)其他多種核轉(zhuǎn)錄因子都沒啥作用；通過化學(xué)生物學(xué)技術(shù)，使 RORγt 受體的內(nèi)源性配體羥基膽固醇帶上熒光基團(tuán)，直接觀察到地高辛能抑制它和 RORγt 的結(jié)合；更細(xì)致的是，作者通過對(duì) RORγt 受體的配體結(jié)合區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)突變后，篩選出單克隆的細(xì)胞株，在 200 個(gè)單克隆細(xì)胞集落里，挑出了 3 個(gè)加了地高辛后熒光素酶信號(hào)沒有減弱的細(xì)胞，再進(jìn)行基因測(cè)序，分析找到了地高辛和 RORγt 受體直接結(jié)合的準(zhǔn)確氨基酸位點(diǎn)。

隨后作者在原代培養(yǎng)的 Th17 免疫細(xì)胞上證實(shí)了地高辛對(duì)其分化的抑制作用。作者做了一個(gè)全轉(zhuǎn)錄組基因分析，經(jīng)過對(duì)測(cè)序結(jié)果的專業(yè)分析比對(duì)，發(fā)現(xiàn)地高辛處理的 Th17 細(xì)胞和敲除 RORγt 受體的 Th17 細(xì)胞，其轉(zhuǎn)錄組有 94% 的相同。

除此之外，作者還研究了一堆正常研究可能不會(huì)去碰的問題來證實(shí)結(jié)論的完整性。比如，如何證實(shí)地高辛是通過直接抑制 RORγt 受體、而非抑制 RORγt 受體的上下游信號(hào)通路來調(diào)節(jié)基因表達(dá)的。作者采取的方法是在一種不表達(dá) ROR 受體的免疫細(xì)胞里分別異位表達(dá)了 RORγt 受體和另一類與 RORγt 共用相同下游信號(hào)通路的同類轉(zhuǎn)錄因子：RORα。

結(jié)果，地高辛只抑制了 RORγt 受體介導(dǎo)的 IL-17 表達(dá)變化，對(duì) RORα介導(dǎo)的 IL-17 表達(dá)變化無影響，這樣就巧妙的排除了 RORγt 受體的上下游信號(hào)通路是地高辛靶點(diǎn)的可能性。

最后，作者關(guān)注了地高辛在臨床治療自身免疫疾病的可行性。包括整體動(dòng)物模型評(píng)價(jià)、中毒劑量和治療劑量的比較、改構(gòu)后衍生物毒性和藥理作用的變化等。不過，有意思的是，作者在討論中并沒有特別看重地高辛臨床用于治療自身免疫疾病的價(jià)值。他們更感興趣的是，人體內(nèi)居然會(huì)有一種以植物成分洋地黃苷作為配體的受體存在，在生物學(xué)上到底意味著什么呢？

其實(shí)近年來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)自身天然存在有洋地黃苷類的化合物，只是生理作用尚不明確，作者認(rèn)為他們的研究說明，這些內(nèi)源性地高辛可能是人體內(nèi)重要的天然免疫化學(xué)武器。結(jié)論相當(dāng)有型。

如何選擇好的研究靶點(diǎn)？CNS 三大雜志報(bào)道該蛋白的重要生物功能不超過 5 年（本文是 3 年）、該生物功能和你的專業(yè)領(lǐng)域高度相關(guān)、但該蛋白卻未在你的專業(yè)領(lǐng)域研究過，可能就是很好的靶點(diǎn)。

你以為做個(gè)藥物對(duì)靶點(diǎn)作用的體外實(shí)驗(yàn)、再做個(gè)體內(nèi)靶點(diǎn)的基因敲除對(duì)藥物效果的影響實(shí)驗(yàn)，就能妥妥地證明你的藥通過你的靶起作用？不說多的，下這個(gè)結(jié)論至少還要考慮兩個(gè)方面：

一是體外對(duì)靶點(diǎn)的作用濃度，和體內(nèi)產(chǎn)生效應(yīng)的濃度是否一致？體內(nèi)有沒有 Biomarker 證實(shí)你的藥引起了你的靶的直接變化；

二是你的藥有沒有可能通過影響你的靶上下游信號(hào)起作用？

文章說洋地黃苷在體內(nèi)都天然存在，什么酒精、甲醛、二甲基亞砜這些工業(yè)原料體內(nèi)也都存在，看來我們的身體真是個(gè)小宇宙。這些東西到底在干神馬呢？快去想吧……

原來地高辛能抑制自身免疫疾病，心內(nèi)科和風(fēng)濕內(nèi)科想報(bào)課題的醫(yī)生朋友們，是不是有種如獲至寶的感覺呢？