⊙編輯：小余

生物分子相互作用是一種基本的生命現(xiàn)象，其相互作用研究是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的重大問題之一?，F(xiàn)在研究相互作用的技術(shù)有：平衡透析法、紫外可見吸收光譜、熒光光譜、電化學(xué)法等。隨著分子生藥研究深入，一些新的檢測技術(shù)問世，如微量熱泳動技術(shù)（MST），那么當(dāng)我們做蛋白相互作用時，面對如此多的技術(shù)，該如何讓選擇？筆者將目前測定小分子與蛋白的體外相互作用，最常用的四種技術(shù)：熒光偏振免疫分析法（fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA）、等溫量熱滴定儀（ITC）、表面離子體共振技術(shù)（SPR）等技術(shù)的原理、操作、應(yīng)用范圍以及優(yōu)缺點做一綜述，供各位研究者參考。其中FPIA和ITC是兩種經(jīng)典方法。

1.熒光偏振免疫分析法（fluorescencepolarization immunoassay，F(xiàn)PIA）

1.1 原理

FPIA是一種定量免疫分析技術(shù)，其基本原理是熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的藍(lán)偏振光（485nm）照射后，吸收光能躍入激發(fā)態(tài)，隨后回復(fù)到基態(tài)，并發(fā)出單一平面的偏振熒光（525nm）。偏振熒光強(qiáng)弱程度與熒光分子的大小呈正相關(guān)，與其激發(fā)時的轉(zhuǎn)動速度呈反相關(guān)。FPIA最適宜檢測小至中等分子物質(zhì)，常用于藥物、激素的測定。

1.2 操作

1.2.1 首先針對所測蛋白，選擇一個陽性藥物，對陽性藥物進(jìn)行熒光標(biāo)記；

1.2.2 配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原（廠家在試劑盒中提供提供已知劑量的非標(biāo)記抗原）；

1.2.3 用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原與一定量的標(biāo)記抗原在一定條件下同限量的特異性抗體進(jìn)行反映；

1.2.4 反應(yīng)達(dá)到平衡后，以反應(yīng)變量作為縱坐標(biāo)，反應(yīng)劑量（一系列標(biāo)準(zhǔn)抗原）作為橫坐標(biāo)，做一條曲線，就得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原對反應(yīng)變量的競爭抑制曲線；

1.2.5 在同等條件下，用待測抗原與一定量的標(biāo)記抗原與限量的特異性抗體進(jìn)行反應(yīng)，并用同樣的方法分離待測抗原中的B和F，測量其放射性，計算出B/F，在劑量反應(yīng)曲線上就可以查出對應(yīng)的抗原濃度。

1.3 注意

在實際操作中要設(shè)置：一是標(biāo)準(zhǔn)抗原量為0，這是沒有標(biāo)準(zhǔn)抗原與標(biāo)記抗原競爭，標(biāo)記抗原和抗體結(jié)合達(dá)最大值；二是為了排除標(biāo)記抗原再發(fā)特異性結(jié)合時出現(xiàn)非特異性結(jié)合（與雜質(zhì)蛋白和容器的管壁結(jié)合等），設(shè)置一個非特異性結(jié)合管(NSB)，NSB管用蒸餾水代替特異抗體，在相同條件下反應(yīng)后測的放射性。

1.4 優(yōu)缺點

1.4.1 優(yōu)點

檢測限低，0.2ng/ml，精密度高，速度快，樣品用量少，儀器不用每日校準(zhǔn)，有顏色和渾濁的溶液不干擾檢測結(jié)果；

1.4.2 缺點

儀器設(shè)備昂貴，藥品試劑盒專屬性強(qiáng)，需進(jìn)口，測一種特異性抗體，需要一種標(biāo)記抗原。

2.等溫量熱滴定儀（ITC）

2.1 原理

ITC是一種量熱或分析技術(shù)，即用一種反應(yīng)物滴定另一種反應(yīng)物，隨著加入滴定劑的數(shù)量的變化，測量反應(yīng)體系溫度的變化。 滴定一般在盡可能接近絕熱的條件下進(jìn)行，被滴定物可以是液體或懸浮的固體；滴定劑可以是液體或氣體。溫度變化是由滴定劑與被滴定物間的化學(xué)作用或物理作用（例如一種有機(jī)分子吸附于固體表面）引起的。在一次實驗中可以測定結(jié)合的親和力常數(shù)K，結(jié)合反應(yīng)中的焓變、熵變，結(jié)合位點，也可以測定有多個結(jié)合位點的樣品。

2.2 操作

2.2.1 樣品池中加入待測大分子；

2.2.2 參照池中加入緩沖液；

2.2.3 將待測配體吸入注射器中；

2.2.4 注射器置于樣品池中；

2.2.5 調(diào)整溫度、攪拌速度和每次注射體積。

2.3 應(yīng)用

分子相互作用（蛋白、核酸、多肽、藥物分子、脂類、金屬離子、小分子等等）、工藝過程的開發(fā)和控制、酶動力學(xué)、藥物研發(fā)、非生物系統(tǒng)等。

2.4 優(yōu)點

2.4.1 無需熒光標(biāo)記，因為熒光素對大分子的結(jié)構(gòu)或空間結(jié)構(gòu)會有影響；

2.4.2 操作簡單（整個過程由計算機(jī)控制，再由Origin軟件分析ITC所得數(shù)據(jù)，減少了人為誤差給實驗帶來的影響）；

2.4.3 樣品用量小，方法靈敏度和精密度高。（滴定池有兩種配制：1ml--所需配體100ul和250ul；190ul---所需配體50ul）；

2.4.4 測定時不需要制成透明清澈溶液，而且量熱試驗完畢的樣品未遭破壞，還可以進(jìn)行后續(xù)生化分析等。

3.表面離子體共振（SPR）

3.1 原理

表面等離子共振是一種物理光現(xiàn)象。利用光在玻璃界面處發(fā)生全內(nèi)反射時的消逝波，可以引發(fā)金屬表面的自由電子產(chǎn)生表面等離子體子在入射角或波長為某一適當(dāng)值的條件下， 表面等離體子與消逝波的頻率和波數(shù)相等， 二者將發(fā)生共振，入射光被吸收，使反射光能量急劇下降，在反射光譜上出現(xiàn)共振峰(即反射強(qiáng)度最低值)。當(dāng)緊靠在金屬薄膜表面的介質(zhì)折射率不同時， 共振峰位置將不同。

3.2 操作

3.2.1 準(zhǔn)備偶聯(lián)物和分析物，純度高的偶聯(lián)物有利于特異性結(jié)合的分析判斷及結(jié)合參數(shù)分析；

3.2.2 選擇合適的芯片并插入固定于儀器系統(tǒng)；

3.2.3 將偶聯(lián)物固定于芯片表面，根據(jù)不同的分析要求，固定相應(yīng)的偶聯(lián)物的量；

3.2.4 將分析物進(jìn)樣與芯片表面使之與偶聯(lián)物結(jié)合，記錄傳感圖譜；

3.2.5 再生芯片表面，選擇合適的再生試劑（高鹽溶液、酸堿溶液等），去除與偶聯(lián)物相結(jié)合的分析物；

3.2.6 分析傳感圖譜，獲取相應(yīng)的分子相互作用信息。

3.3 應(yīng)用

可與納米技術(shù)、液質(zhì)等技術(shù)連用，用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究、高通量篩選、分子相互作用、腫瘤相關(guān)DNA標(biāo)記等。

3.4 優(yōu)缺點

3.4.1 優(yōu)點

可進(jìn)行實時檢測，無需樣品標(biāo)記，樣品用量少，靈敏度高，能測定渾濁甚至不透明樣品等；

3.4.2 缺點

蛋白在芯片表面固定比較困難，非特異性結(jié)合等。

4.微量熱泳動技術(shù)（MST）

4.1 原理

微量熱泳動技術(shù)(Microscale Thermophoresis,MST)通過測量微觀溫度梯度場中的分子移動來分析生物分子間的相互作用。該技術(shù)能夠測量出分子大小、電荷以及水化層變化引起的移動速度的改變，具有極高的靈敏度。

4.2 操作

4.2.1 查閱文獻(xiàn)確定蛋白穩(wěn)定狀態(tài)下的buffer緩沖液；

4.2.2 對所測蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記（MST 115款儀器；若為MST laberfree款儀器則不需要對蛋白進(jìn)行標(biāo)記。具體選擇那款儀器測定應(yīng)根據(jù)蛋白的結(jié)構(gòu)確定，若蛋白分子中色氨酸多處于暴露狀態(tài)，則首選MST laber free款儀器；否則MST 115款儀器，選擇紅色或藍(lán)色染料對蛋白分子進(jìn)行熒光標(biāo)記）；

4.2.3對標(biāo)記蛋白或蛋白進(jìn)行熒光測定（300<><>

4.2.4 配制1:1配體溶液，加入蛋白分子，混勻，儀器檢測。

4.3 應(yīng)用

主要應(yīng)用于生物分子間互作領(lǐng)域，主要包括寡糖核苷酸間的互作、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與核酸之間、蛋白與藥物分子之間等。

4.4 優(yōu)點

4.4.1 不需固定蛋白；

4.4.2 對蛋白可以標(biāo)記測定，也可不標(biāo)記測定；

4.4.3 快速、高效；

4.4.4 接近天然的測量環(huán)境：可以在血清和細(xì)胞裂解液之中測量；

4.4.5 簡單易操作：簡單的樣品準(zhǔn)備和直觀的軟件界面等。

綜上所述，上述4種方法是目前測定蛋白與分子互作的最常用的方法，其中熒光偏振免疫分析法（fluorescencepolarization immunoassay，F(xiàn)PIA）和等溫量熱滴定儀（ITC）兩種方法被認(rèn)為是經(jīng)典方法。然而每種方法都不是萬能的，有自己長處，我們應(yīng)結(jié)合自己實驗?zāi)康?，以及生物樣品的特性選擇合適的方法進(jìn)行檢測。目前，若是測定蛋白與分子體外互作，會首選MST，用該方法檢測得到一種結(jié)果，再用兩種經(jīng)典方法——熒光偏振免疫分析法（fluorescencepolarization immunoassay，F(xiàn)PIA）或等溫量熱滴定儀（ITC）中一種方法進(jìn)行蛋白與分子互作實驗結(jié)果驗證。結(jié)合兩種方法的檢測結(jié)果，確定蛋白與分子互作結(jié)果，為下一步生物實驗打下基礎(chǔ)，避免了研究人員研究時走彎路、浪費時間、精力、財力等情況出現(xiàn)。相信在將來會有更先進(jìn)、精密的測定蛋白與分子互作儀器出現(xiàn)。

參考文獻(xiàn)：略。

[本