伴隨著工業(yè)、城市污染的加劇和農(nóng)用化學(xué)物質(zhì)種類(lèi)、數(shù)量的增加，土壤重金屬污染程度也正在加劇，污染面積在逐年擴(kuò)大。據(jù)有關(guān)統(tǒng)計(jì)報(bào)道，目前，我國(guó)重金屬污染土壤2000萬(wàn)hm2左右，每年因土壤重金屬污染而造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)100多億元［1］。另一方面，土壤重金屬污染具有隱蔽性、積累性、滯后性和長(zhǎng)期性的特點(diǎn)，存在修復(fù)難度大、去除效果不理想等問(wèn)題［2］。因此，重金屬污染土壤修復(fù)成為環(huán)境科學(xué)研究中的熱點(diǎn)，我國(guó)也把重金屬污染列入優(yōu)先控制之列［3］。在眾多去污染土壤修復(fù)技術(shù)中，土壤淋洗技術(shù)被認(rèn)為是一種可廣泛應(yīng)用的、很有發(fā)展?jié)摿Φ男迯?fù)方法［4］，其中研究應(yīng)用較廣泛的是生物表面活性劑淋洗修復(fù)技術(shù)。例如，朱清清等［2］研究了皂角苷在不同濃度、pH值條件下對(duì)土壤重金屬去除影響，結(jié)果表明，當(dāng)皂角苷濃度為50g/L、pH值為5.2時(shí)，土壤中Cd、Cu、Zn和Pb的去除率分別達(dá)45.6%、24.4%、19.0%和17.6%，說(shuō)明生物表面活性劑對(duì)土壤重金屬的去除有一定的效果，但土壤污染呈現(xiàn)出多樣性和復(fù)合性，生物表面活性劑修復(fù)效果不理想。

生物酶是一種生物螯合劑，它具有對(duì)環(huán)境營(yíng)養(yǎng)條件要求不高;低濃度污染物，處理更有效;在和毒物共存時(shí)能保持較高活性;在土壤中具有較大的移動(dòng)性;微生物吸收有機(jī)物和重金屬時(shí)需借助特定吸收機(jī)制(擴(kuò)散和滲透)，而酶不需要等優(yōu)點(diǎn)，比微生物、植物對(duì)重金屬污染土壤的處理更具有優(yōu)勢(shì)。當(dāng)酶遇到重金屬時(shí)，重金屬與底物競(jìng)爭(zhēng)，重金屬同時(shí)進(jìn)入，與底物結(jié)合形成“酶-重金屬-底物”的絡(luò)合物，能降解和轉(zhuǎn)化土壤中的污染物，使污染物的濃度降低到可接受的濃度，土壤修復(fù)效果較好［7］。利用生物酶可有效提高重金屬污染土壤的處理效果，此方面研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究將生物酶溶液應(yīng)用于污染土壤中重金屬Cd、Cr、Cu、Ni、Zn的淋洗、解吸、去除，以提高重金屬的去除效果。論文探討了酶的種類(lèi)、酶的質(zhì)量濃度、pH、反應(yīng)時(shí)間等對(duì)重金屬去除率的影響，并利用響應(yīng)面法對(duì)去除反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，試圖為淋洗修復(fù)重金屬污染土壤提供新方法。

1材料與方法

1.1供試土壤土壤樣品采自武夷山市武夷學(xué)院湖邊的耕地土壤，屬于粘土性土壤。樣品經(jīng)自然風(fēng)干后，研碎，過(guò)100目尼龍篩。人工污染土壤樣品:將100g土壤樣品浸入500mLCuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、Cd(NO3)2·4H2O、Cr(NO3)3·9H2O、NiCl2·6H2O配制的混合溶液中(該溶液含Cu100.5mg/L、Zn439.7mg/L、Cd4.8mg/L、Cr365.2mg/L、Ni128.1mg/L)，25℃恒溫振蕩72h，4000r/min離心除去上層清液，自然風(fēng)干陳化2周，備用，即為供試土壤樣品。經(jīng)測(cè)試，該人工污染土壤樣品pH為6.80，有機(jī)質(zhì)含量為2.87%，陽(yáng)離子交換容量為12.45cmol/kg，Cd、Cr、Cu、Ni、Zn含量分別為2.38、93.33、279.38、148.39和89.68mg/kg。

1.2試劑與儀器試劑:α-淀粉酶，脲酶，過(guò)氧化物酶(生化試劑，上海鶴善實(shí)業(yè)有限公司);其他試劑均為市售分析純?cè)噭瑢?shí)驗(yàn)用水為去離子水。儀器:AA-6300原子吸收分光光度計(jì)(日本島津公司)，SHA-C恒溫振蕩箱(常州國(guó)華電器有限公司)，TDL-40B離心機(jī)(上海安亭科技儀器廠(chǎng))，PB-10型pH計(jì)(德國(guó)賽多利斯集團(tuán))，AB204-S電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)用酶的選用取0.6g供試土壤樣品置于錐形瓶中，分別加入質(zhì)量濃度為0.1%的不同酶溶液15mL，在25℃、pH4.0條件下恒溫振蕩12h，離心后，取上清液用火焰原子吸收分光光度法測(cè)定各重金屬的含量。

1.3.2酶溶液處理重金屬污染土壤各工藝條件的確定取0.6g供試土壤樣品置于錐形瓶中，加入一定量的酶溶液，在不同的反應(yīng)時(shí)間、pH條件下，25℃恒溫振蕩。離心后，取上清液測(cè)定各重金屬的含量。

1.3.3酶溶液處理重金屬污染土壤工藝條件的優(yōu)化取0.6g供試土壤樣品分別加入酶溶液15mL，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，在單因素的基礎(chǔ)上，以淋洗液的pH、反應(yīng)時(shí)間、酶質(zhì)量濃度3個(gè)因素為自變量，重金屬去除率為響應(yīng)值，作3因素3水平的響應(yīng)曲面分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1，確定土壤重金屬去除的最佳工藝條件。

2結(jié)果與分析

2.1實(shí)驗(yàn)用酶的選用酶作為土壤的組成部分，參與土壤系統(tǒng)中許多重要的代謝過(guò)程，因而可用它來(lái)檢測(cè)土壤中重金屬的相對(duì)污染程度［8］。其反應(yīng)機(jī)理是重金屬與酶活性中心結(jié)合或與酶分子中的巰基、胺基和羧基的結(jié)合，從而改變酶的活性。因此，酶依靠其專(zhuān)一性、高效性，與重金屬產(chǎn)生良好的絡(luò)合作用，從而達(dá)到去除土壤中重金屬的目的。實(shí)驗(yàn)選擇土壤中常見(jiàn)脲酶、過(guò)氧化氫酶和α-淀粉酶溶液各15mL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)供試復(fù)合污染土壤樣品進(jìn)行處理，在25℃、pH4.0條件下恒溫振蕩12h，以求達(dá)到良好的去除效果和降低處理成本。由圖1可知，脲酶、過(guò)氧化氫酶、α-淀粉酶對(duì)土壤中重金屬的去除都有一定的效果，但效果差異顯著，去除率的大小順序?yàn)棣?淀粉酶＞過(guò)氧化氫酶＞脲酶。其主要原因可能是，脲酶活性對(duì)重金屬最敏感，與重金屬的污染程度呈良好的負(fù)相關(guān)關(guān)系［8］，因此重金屬在濃度較低時(shí)，脲酶空間結(jié)構(gòu)迅速變化而失活，無(wú)法進(jìn)一步絡(luò)合重金屬;過(guò)氧化氫酶活性對(duì)重金屬Cu、Ni含量表現(xiàn)較敏感，故過(guò)氧化氫酶對(duì)部分重金屬如Cu、Ni，絡(luò)合效果差，對(duì)其他類(lèi)型的重金屬有一定的絡(luò)合效果，去除重金屬效果要好于脲酶;重金屬與α-淀粉酶沒(méi)有專(zhuān)一性對(duì)應(yīng)關(guān)系，酶活性沒(méi)有受到影響，對(duì)重金屬有良好的絡(luò)合效果。

2.2不同反應(yīng)條件對(duì)重金屬去除效果的影響

2.2.1pH值對(duì)重金屬去除率的影響pH值對(duì)酶的生物活性會(huì)造成影響，還會(huì)對(duì)土壤中各重金屬的賦存形態(tài)造成影響，是影響土壤重金屬去除率的重要因素。在酸性條件下，土壤中的重金屬主要以酸提取態(tài)存在;pH越低，土壤中重金屬游離越多，活性越強(qiáng)。蔣煜峰等［9］發(fā)現(xiàn)，隨土壤pH值增加，重金屬解吸率逐漸減小，皂角苷沖洗土壤重金屬的適宜pH應(yīng)在4～5。實(shí)驗(yàn)選擇pH值3.0～5.0范圍內(nèi)考察pH對(duì)重金屬去除率的影響。由圖2可知，在所研究的pH范圍內(nèi)，pH值低，α-淀粉酶對(duì)重金屬的去除率較高，當(dāng)pH為3.5時(shí)，去除率達(dá)到最大值。隨著pH值繼續(xù)增加，去除率降低。這種變化一方面與酶本身結(jié)構(gòu)有關(guān):在酸性條件下，α-淀粉酶分子中的巰基和羧基易分解，與重金屬產(chǎn)生良好的絡(luò)合。另一方面，與各金屬的賦存形態(tài)有關(guān):在酸性條件下，Cd、Cr2種重金屬在土樣中的存在形態(tài)以酸提取態(tài)(即離子態(tài))為主，去除率高;Cu、Zn、Ni在土樣中的存在形態(tài)以可還原態(tài)、可氧化態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)為主，去除較困難，去除率較低。

2.2.2酶的質(zhì)量濃度對(duì)重金屬去除率的影響重金屬在土壤中的存在狀態(tài)大多數(shù)是吸附并固定在有機(jī)質(zhì)和土壤粘粒上，以吸附態(tài)存在［10］。由圖3可知，酶質(zhì)量濃度低于0.20%時(shí)，重金屬去除率隨酶濃度的升高而增加。Mulligan等［11］研究認(rèn)為，在重金屬未與土壤分離時(shí)，酶就已經(jīng)與重金屬絡(luò)合了，使金屬?gòu)耐寥郎辖馕聛?lái)，隨著淋洗液不斷的沖洗，金屬就被從土壤中去除。在低濃度時(shí)，酶主要與土壤中游離的金屬絡(luò)合，重金屬的去除率低;隨著酶濃度的增大，土壤中重金屬進(jìn)入酶的活性中心，與酶分子的巰基、胺基和羧基結(jié)合，重金屬不與土壤顆粒的重新結(jié)合，重金屬的去除率也隨之增加。當(dāng)酶濃度超過(guò)0.20%時(shí)，與還原態(tài)、可氧化態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)的各重金屬的解吸與吸附達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，重金屬去除率不再發(fā)生較大變化。不同重金屬去除率差別較大，可能是由于重金屬的存在形態(tài)以及重金屬與酶的絡(luò)合能力不同造成的。

2.2.3反應(yīng)時(shí)間對(duì)重金屬去除率的影響由圖4可知，各重金屬去除率隨反應(yīng)時(shí)間增加而上升，在反應(yīng)時(shí)間為12h時(shí)，Cd、Cr、Cu、Ni和Zn去除率分別為69.56%、58.05%、35.72%、32.67%和53.39%。隨后，重金屬去除率不再變化。其可能與金屬離子在土壤中賦存狀態(tài)、酶的傳質(zhì)速率機(jī)理和酶的反應(yīng)機(jī)理有關(guān)。反應(yīng)初期，酶分子吸附在土壤顆粒表面，重金屬的去除率低;隨著振蕩時(shí)間增加，酶的傳質(zhì)速率提高，進(jìn)入土壤中與重金屬相結(jié)合，去除率得到提高;當(dāng)酶的活性中心達(dá)到飽和，與重金屬的絡(luò)合反應(yīng)達(dá)到平衡，重金屬的去除率趨于穩(wěn)定。

2.3酶溶液處理重金屬污染土壤最佳工藝條件的確定

2.3.1酶溶液處理重金屬污染土壤實(shí)驗(yàn)分析和回歸方程建立(以Cd含量方差分析表為例)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，采用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)安排及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得二次多元回歸方程為。對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可知，模型具有高度顯著性(P＜0.01)，而Ｒ2=0.9651，Ｒ2Adj=0.9203較高，可見(jiàn)回歸方程擬合度和可信度均較高，實(shí)驗(yàn)誤差較小，方程模擬得較好，可用于組合液去除污染土壤中Cd的實(shí)驗(yàn)分析與預(yù)測(cè)。通過(guò)回歸模型的響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖(見(jiàn)圖5～圖7)，能夠很直接地看出反應(yīng)因素之間兩兩交互作用對(duì)去除率的影響。從圖5～圖7可知，pH、反應(yīng)時(shí)間、酶濃度的交互作用較顯著(圓形表示二因素交互作用不顯著，橢圓表示二因素交互作用顯著)［15］。其中各因素在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)去除率的影響大小依次為pH(A)＞反應(yīng)時(shí)間(B)＞α-淀粉酶的質(zhì)量濃度(C)。這3個(gè)實(shí)驗(yàn)因素對(duì)去除率均產(chǎn)生不同程度的影響。在各因素選取的范圍內(nèi)，通過(guò)DesignExpert軟件分析回歸模型，得出Cd最優(yōu)去除率的工藝參數(shù)為:pH3.5、反應(yīng)時(shí)間12h、α-淀粉酶的質(zhì)量濃度0.20%，Cd去除率預(yù)測(cè)值為82.172%。為檢驗(yàn)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化提取條件進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得Cd去除率為82.36%，與理論預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差為2.3‰，結(jié)果較理想。

2.3.2酶溶液處理重金屬污染土壤實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果分析本實(shí)驗(yàn)利用響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)分析方法還對(duì)Cr、Cu、Ni、Zn進(jìn)行分析，結(jié)果表明，回歸方程擬合度和可信度均較高，實(shí)驗(yàn)誤差較小，方程模擬的較好，可用于污染土壤中Cr、Cu、Ni、Zn實(shí)驗(yàn)分析與預(yù)測(cè)。各因素在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)去除率的影響大小依次都為pH(A)＞反應(yīng)時(shí)間(B)＞α-淀粉酶的質(zhì)量濃度(C)。在各因素選取的范圍內(nèi)，通過(guò)DesignExpert軟件分析回歸模型，得出最優(yōu)去除率的工藝參數(shù)也為:pH3.5、反應(yīng)時(shí)間12h、α-淀粉酶質(zhì)量濃度0.20%。ＲSM預(yù)測(cè)出來(lái)的最佳結(jié)果Cr、Cu、Ni和Zn分別為75.02%、38.38%、34.69%和57.54%。為檢驗(yàn)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化提取條件進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終Cr、Cu、Ni和Zn去除率分別為75.44%、38.34%、34.74%和57.69%，與理論預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差分別為5.6‰、1.1‰、1.3‰和0.3‰，結(jié)果較理想。5種重金屬去除率的大小順序?yàn)镃d＞Cr＞Zn＞Cu＞Ni。

3討論

不同的酶對(duì)土壤中重金屬去除具有一定選擇性。與重金屬無(wú)專(zhuān)一性對(duì)應(yīng)關(guān)系的酶，對(duì)重金屬有良好的去除效果。α-淀粉酶是較理想的重金屬絡(luò)合劑，對(duì)酸提取態(tài)、可還原態(tài)和可氧化態(tài)的重金屬有一定的去除效果，說(shuō)明α-淀粉酶用于重金屬污染的土壤的生態(tài)修復(fù)是可行的。采用α-淀粉酶溶液作為淋洗液，通過(guò)響應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化得到，以pH3.5、反應(yīng)時(shí)間12h、α-淀粉酶的質(zhì)量濃度0.20%為最佳淋洗修復(fù)條件，Cd、Cr、Cu、Ni和Zn去除率分別為82.36%、75.02%、38.38%、34.69%和57.54%，去除率的大小順序?yàn)镃d＞Cr＞Zn＞Cu＞Ni，此時(shí)Cd、Cr、Cu、Ni、Zn在供試土壤中含量分別由2.38、93.33、279.38、148.39和89.68mg/kg降低到0.41、23.31、172.15、96.91和38.08mg/kg。采用《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB15618-1995)分析可知，Cd、Cr、Cu、Ni、Zn等重金屬的土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)值經(jīng)生物酶處理后分別由3級(jí)或2級(jí)，提升到2級(jí)或1級(jí)，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有一定的提高。表明酶對(duì)土壤中重金屬有較好的去除效果，酶是土壤的組成部分，利用酶修復(fù)重金屬污染的土壤，可以降低環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，具有一定的應(yīng)用前景。

作者：林維晟 吳海泉 胡家朋 黃雪婷 徐穎惠 單位：武夷學(xué)院生態(tài)與資源工程學(xué)院 綠色化工技術(shù)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建邵化化工有限公司