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專利名稱分子的糖基化的制作方法 技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及獲得糖基化的分子，特別是蛋白質(zhì)和脂質(zhì)分子的方法。 背景 高效表達系統(tǒng)是生產(chǎn)大多數(shù)目前正在開發(fā)中的生物藥物(例如，重組蛋 白)所需要的。許多這些生物藥物的生物學活性依賴于它們的修飾(例如，磷 酸化或糖基化)。 一種基于酵母的表達系統(tǒng)將遺傳操作和微生物發(fā)酵的簡易 性與分泌和修飾蛋白的能力相結(jié)合。然而，酵母細胞中產(chǎn)生的重組糖蛋白主 要展現(xiàn)為異質(zhì)性的高甘露糖和超甘露糖聚糖結(jié)構(gòu)(high-mannose and hyper-mannose glycan structures),其可能7十蛋白質(zhì)功能、下游力口工和后續(xù)治 療用途有害，特別是在糖基化扮演重要的生物學角色的情況下。 概述 本發(fā)明至少部分基于(a)發(fā)現(xiàn)解脂西洋蓍霉(]^rovWa /少; o/仏'ca)細胞中 的單個基因缺失(外部鏈延長(Outer CHain elongation) (OCHl)缺失)導(dǎo)致基本 上均質(zhì)產(chǎn)生在MansGlcNAc2(結(jié)構(gòu)式IV;圖l)骨架上具有a-l,2-連接的甘露 糖殘基的糖基化蛋白質(zhì)；(b)發(fā)現(xiàn)靶向解脂西洋蓍霉細胞(具有和不具有OCH1 缺失的兩種細胞)ER的經(jīng)工程化的a-l，2-甘露糖苷酶的過表達導(dǎo)致基本上均 質(zhì)產(chǎn)生具有MansGlcNAc2N-聚糖結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)式IV;圖l)的糖基化蛋白；(c) 發(fā)現(xiàn)使解脂西洋蓍霉細胞中天冬酰胺連接的糖基化3 (ALG3)酶活性失活導(dǎo) 致糖基化聚糖水平的高度增加；和(d)發(fā)現(xiàn)解脂西洋蓍霉細胞中解脂西洋蓍霉 基因(MNN4)的過表達導(dǎo)致a-1,2-連接的甘露糖殘基的超磷酸化 (hyperphosphorylation)。如此，遺傳工程化的細胞(例如，解脂西洋蓍霉 (Kwrow/a /j[po/'/ca)、 ^rxw/a at/em'w/vora's,或其它相關(guān)種類的雙態(tài)性酵母細 胞)可以在產(chǎn)生如下目標分子的方法中使用，所述目標分子如與在未經(jīng)遺傳 工程化的相同種類的細胞中產(chǎn)生的目標分子的N-糖基化形式相比具有改變 的N-糖基化形式。向患有代謝紊亂(例如，溶酶體貯積病(lysosomal storagedisorder))的患者施用N-糖基化的目標分子(例如，N-糖基化蛋白)已被證明可 改善所述病癥的癥狀，所描述的方法和細胞可用于制備N-糖基化的目標分 子用于治療，包括但不限于，代謝紊亂，例如溶酶體貯積病。 本發(fā)明還至少部分基于解脂西洋蓍霉和巴斯德畢赤酵母(尸&/^ IIAC1基因的剪接形式的發(fā)現(xiàn)。由HAC1基因編碼的蛋白質(zhì)Haclp是轉(zhuǎn)錄激 活因子，其通過與稱為未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答(Unfolded Protein Response) (UPR) 元件的DNA序列基序結(jié)合而激活數(shù)個靶基因的轉(zhuǎn)錄。在Haclp耙基因之中 包括編碼侶伴蛋白、折疊酶(foldase)和負責脂質(zhì)和肌醇代謝的蛋白質(zhì)的那些。 由于經(jīng)剪接形式Haclp是比由未經(jīng)剪接的HAC1 mRNA所編碼的形式更強 力的轉(zhuǎn)錄激活因子，所以Haclp轉(zhuǎn)錄因子的經(jīng)剪接形式的過表達能夠?qū)е绿?然和異源蛋白表達水平的增加，以及在ER膜中的增加。由此，Haclp的經(jīng) 剪接形式能夠用于在多種真核細胞(例如，真菌細胞(例如，解脂西洋蓍霉或 任何其它本文描述的酵母細胞)、植物細胞或動物細胞(例如，哺乳動物細胞 的產(chǎn)生。 ，5 、， ' 本發(fā)明還基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即在解脂西洋蓍霉中表達時，MNS1甘露糖 香酶的突變形式能夠?qū)an8GlcNAc2 (結(jié)構(gòu)式I;圖4)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成 Man5GlcNAc2 (結(jié)構(gòu)式IV;圖4)、 Man6GlcNAc2 (結(jié)構(gòu)式V;圖4)和 Man7GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式VI;圖4)。由此，表達甘露糖苷酶如MNS1的突變形 式的遺傳工程化的真核細胞(例如，真菌細胞(例如，解脂西洋蓍霉或任何 其它本文描述的酵母細胞)、植物細胞或動物細胞(例如，哺乳動物細胞如人 的細胞))能夠在產(chǎn)生如下目標分子的方法中使用，所述目標如與在未經(jīng)遺傳 工程化的相同種類的細胞中產(chǎn)生的目標分子的N-糖基化形式相比具有改變 的N-糖基化形式。因此，所描述的方法和細胞可用于制備N-糖基化的目標 分子用于治療，包括但不限于，代謝紊亂，例如溶酶體貯積病(見下文)。 在一個方面，本公開描述了產(chǎn)生目標蛋白的改變的N-糖基化形式的方 法。所述方法包括向細胞引入編碼目標蛋白的核酸的步驟，其中所述細胞產(chǎn) 生N-糖基化形式改變的目標蛋白，并且其中所述細胞是經(jīng)遺傳工程化而含 有至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性的解脂西洋蓍霉或^n:w/a twfew'm'wrara 細胞(或相關(guān)種類的雙態(tài)性的酵母細胞)。所述方法也可包括提供經(jīng)遺傳工程 化而含有至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性的解脂西洋蓍霉或^rxw/a 12c^em''/vora/w細胞(或相關(guān)種類的雙態(tài)性的酵母細胞)的步驟。所述方法也可 包括分離目標蛋白的改變的N-糖基化形式的步驟。 在一些實施方案中，目標蛋白可以是內(nèi)源蛋白或外源蛋白。目標蛋白可 以是哺乳動物蛋白如人的蛋白。目標蛋白可以是例如，病原體蛋白、溶酶體 蛋白、生長因子、細胞因子、趨化因子、抗體或其抗原結(jié)合片段，或融合蛋 白。融合蛋白可以是例如，病原體蛋白、溶酶體蛋白、生長因子、細胞因子 或趨化因子與抗體或其抗原結(jié)合片段的融合物。目標蛋白可以是例如，與溶 酶體貯積病(LSD)相關(guān)的蛋白質(zhì)。目標蛋白可以是例如，葡糖腦香酯酶、半 乳糖腦苷酯酶、a-L-艾杜糖苷酸酶、(3-D-半乳糖苷酶、P-葡糖苷酶、P-己糖 胺酶、P-D-甘露糖苷酶、a-L-巖藻糖芬酶、芳基碌^酸酯酶B、芳基^L酸酯酶 A、 a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acteylgalactosaminidase)、天冬氨酰葡糖胺酶 (aspartylglucosaminidase)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、a-氨基葡糖苷-N-乙酰轉(zhuǎn) 移酶、(3-D-葡糖醛酸酶(p-D-glucoronidase)、透明質(zhì)酸酶、a-L-甘露糖苷酶、 a-神經(jīng)氨酸酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、酸性脂肪酶、酸性神經(jīng)酰胺酶、鞘磷脂酶 (sphinogmyelinase)、石危酯酶、組織蛋白酶K或脂蛋白脂肪酶。 在一些實施方案中，改變的N-糖基化形式可以含有一種或多種N-聚糖 結(jié)構(gòu)如，例如，Man5GlcNAc2、 Man8GlcNAc2、 Man9GlcNAc2、 Man3GlcNAc2、 GlClMan5GlcNAc2、 Glc2Man5GlcNAc2。在一些實施方案中，改變的糖基化可 以是，例如，Man5GlcNAc2、 Man8GlcNAc2、 Man9GlcNAc2、 Man3GlcNAc2、 GlCiMan5GlcNAc2、 Glc2Man5GlcNAc2。 在一些實施方案中，目標蛋白的改變的N-糖基化形式可以是均質(zhì)的或 基本上均質(zhì)的。例如，含有改變的糖基化的改變的目標分子的分數(shù)可以是至 少約20%,至少約30%,至少約40%,至少約45%,至少約50%,至少約 55%,至少約60% ，至少約65%，至少約70%，至少約75%，至少約80%， 至少約85%,至少約90%,或至少約95%或更多。 在一些實施方案中，細胞可以經(jīng)遺傳工程化而缺乏至少一種N-糖基化 活性。所述N-糖基化活性可以是，例如，ALG3活性、OCH1活性、MNS1 活性或MNN9活性。 在一些實施方案中，至少一種修飾可以是(a)缺失編碼具有N-糖基化 活性的蛋白質(zhì)的基因；(b)表達具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的突變形式；(c) 引入或表達干擾具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的功能性表達的RNA分子；(d) 13表達具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)(例如ALG6或a-甘露糖香酶(例如，耙向內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)的a-甘露糖苷酶)。表達的蛋白質(zhì)可以是由細胞中的內(nèi)源核酸編碼的蛋 白質(zhì)。表達的蛋白質(zhì)可以是最適pH在7.5以下的(例如，最適pH在5.1以下) 的a-甘露糖苷酶。具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)可以是外源蛋白。具有N-糖 基化活性的蛋白質(zhì)可以是哺乳動物蛋白(如人的蛋白)或低等真核生物的(例 如，真菌、原生動物或錐蟲)蛋白。低等真核生物可以選自下組布氏錐蟲 (7Vpa/70^oma 6rwcez')、 口合茨木審(7h.c/ oc/erma Aarz/awt/m)、 # ^(/41yperg///w1s)， 和任何其它本文描述的低等真核生物。 在一些實施方案中，N-糖基化活性可以是葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性。在一些 實施方案中，具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是ALG6或a-甘露糖苷酶。a-甘 露糖香酶可以靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。例如，具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)可以是融合 蛋白，其包含a-甘露糖苷酶多肽和HDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留肽(HDEL end叩lasmic reticulum retention peptide)。 在一些實施方案中，具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)可以是能夠從 Maii5GlcNAc2去除葡萄糖殘基的蛋白質(zhì)。例如，具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì) 可以是具有a-l,3-葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)，例如，但不限于，葡糖苷酶II(例 如，葡糖苷酶II的a和卩亞基之一或二者)或變聚糖酶(mutanase)。 在一些實施方案中，細胞可以經(jīng)遺傳工程化而包含至少兩種經(jīng)修飾的N 糖基化活性，例如任何本文描述的經(jīng)修飾的N-糖基化活性。所述至少兩種 經(jīng)修飾的N-糖基化活性可以包含，例如，ALG3活性的缺乏和升高的ALG6 活性水平。 在一些實施方案中，細胞可以經(jīng)遺傳工程化而包含至少三種經(jīng)修飾的 N-糖基化活性，例如任何本文描述的經(jīng)修飾的N-糖基化活性。所述至少三 種經(jīng)修飾的N-糖基化活性可以包含，例如，ALG3活性的缺乏；升高的ALG6 活性水平；和升高的葡糖苷酶II活性水平。 在一些實施方案中，細胞未經(jīng)遺傳工程化而缺乏OCHl活性。 在一些實施方案中，修飾可以包含表達能夠影響目標蛋白的甘露糖基磷 酸化的蛋白質(zhì)或其生物活性的變體。所述能夠影響目標蛋白的甘露糖基磷酸 化的蛋白質(zhì)或其生物活性的變體可以是MNN4、 PN01或MNN6。在一些實 施方案中，糖蛋白的至少約30%的甘露糖基殘基可以是磷酸化的。 在一些實施方案中，所述方法可進一步包括對糖蛋白的額外加工。額外 14加工可以發(fā)生在體外或體內(nèi)。額外加工可以包括將異源模塊(moiety)添加到 修飾的糖蛋白。異源模塊可以是聚合物或載體。額外加工可以包括對目標蛋 白的改變的N-糖基化形式酶處理或化學處理。例如，額外加工可以包括用 甘露糖苷酶、甘露聚糖酶、磷酸二酯酶、葡糖苷酶或糖基轉(zhuǎn)移酶處理目標蛋 白的改變的N-糖基化形式。額外加工可以包括用氫氟酸處理目標蛋白的改 變的N-糖基化形式。額外加工可以包括目標蛋白的改變的N-糖基化形式的 磷酸化。 在另 一 方面，本公開提供產(chǎn)生目標蛋白的改變的N-糖基化形式的方法。 本方法包括如下步驟提供經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基 化活性的真核細胞(例如，真菌細胞、植物細胞或動物細胞)；和向細胞引入 編碼目標蛋白的核酸，其中所述細胞產(chǎn)生N-糖基化形式改變的目標蛋白。 在另一方面，本公開描述了產(chǎn)生目標蛋白的改變的N-糖基化形式的方 法。所述方法包括將目標蛋白與,人角年月旨西洋蓍霉或爿n:w/a acfem'm'vorara細月包 制備的細胞裂解物接觸的步驟，所述解脂西洋蓍霉或Axw/g ^fe'/m'wraw 細胞經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性，其中將目標蛋 白與所述細胞裂解物接觸導(dǎo)致目標蛋白的改變的N-糖基化形式。 在又一方面，本公開描述產(chǎn)生目標蛋白的改變的N-糖基化形式的方法， 所述方法包括將目標蛋白與 一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)接觸的 步驟，其中所述一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)獲得自經(jīng)遺傳修飾 而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性的解脂西洋蓍霉或Jr:a^ a&m'm'vora似細胞，并且其中將目標分子與一種或多種具有N-糖基化活性的 蛋白質(zhì)接觸導(dǎo)致目標蛋白的改變的N-糖基化形式。 在另一方面，本公開提供N-糖基化改變的分離的蛋白質(zhì)，其中所述蛋 白質(zhì)由任一上述方法產(chǎn)生。 在又一方面，本公開提供分離的經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的 N-糖基化活性的解脂西洋蓍霉或^n:w/a a&w'w'vora附細胞(或其它相關(guān)種類 的雙態(tài)性的酵母細胞)。所述N-糖基化活性可以是，例如，ALG3活性、OCH1 活性、MNS1活性或MNN9活性。所述修飾可以是任何本文所述的那些修飾。 例如，所述修飾可以包括(a)缺失編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因； (b)表達具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的突變形式；(c)引入或表達干擾具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的功能性表達的RNA分子；或(d)表達具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)。具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)可以是例如，ALG6。具有N-糖基 化活性的蛋白質(zhì)可以是哺乳動物蛋白，例如人的蛋白。所述修飾也可以包括 表達能夠促進經(jīng)修飾糖蛋白的甘露糖基磷酸化的蛋白質(zhì)(例如，MNN4或 PNOl)或其生物學活性的變體。 在另一方面，本公開提供治療病癥的方法，所述病癥可以通過施用N-糖基化改變的蛋白質(zhì)來治療。所述方法包括向受試者施用如下蛋白質(zhì)的步 驟，所述蛋白質(zhì)可以通過上述任何方法獲得，其中所述受試者是患有或疑似 患有可通過施用N-糖基化改變的蛋白質(zhì)來治療的疾病的患者。所述方法也 可以包括如下步驟(a)提供受試者和/或(b)測定該受試者是否患有可以通過 施用N-糖基化改變的蛋白質(zhì)來治療的疾病。所述受試者可以是哺乳動物如 人。所述病癥可以是例如，癌癥，免疫病癥(例如，炎性狀態(tài))或代謝紊亂。 代謝紊亂可以是任何本文描述的那些代謝紊亂，例如，溶酶體貯積病(LSD) 如高歇爾氏病(Gaucher disease),泰-沙二氏病(Tay-Sachs disease)、旁姆普氏 病(Pompe disease)、 尼-皮二氏病(Niemann-Pick disease)或法布里氏病(Fabry disease)。所述蛋白質(zhì)可以是與LSD相關(guān)的蛋白質(zhì)，例如，所述蛋白質(zhì)可以 是，例如，葡糖腦香酯酶、a-半乳糖苷酶。所述蛋白質(zhì)可以是，例如，oc-L-艾杜糖苷酸酶、P-D-半乳糖苷酶、p-葡糖苷酶、(3-己糖胺酶(hexosaminidase)、 卩-D-甘露糖苷酶、a-L-巖藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、 a-N-乙酰半乳糖胺酶、天冬氨酰葡糖胺酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、a-氨基葡糖 苦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、(3-D-葡糖醛酸酶、透明質(zhì)酸酶、a-L-甘露糖苷酶、a-神經(jīng) 氨酸酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、酸性脂肪酶、酸性神經(jīng)酰胺酶、鞘磷脂酶 (sphinogmyelinase)、石克酯酶、組織蛋白酶K或脂蛋白脂肪酶。 在另 一 方面，本公開提供解脂西洋蓍霉或y^;w/a 'Am''/vorara細胞(或 其它相關(guān)種類的雙態(tài)性的酵母細胞)的基本上純的培養(yǎng)物，其中大量細胞是 經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾(例如任何本文所述的修飾)的N-糖基 化活性的。所述細胞培養(yǎng)物可以包含一種或多種細^9包亞群，各亞群包含不同 的經(jīng)修飾的糖基化活性。 在又一方面，本公開提供(a)包含SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的分 離的核苷酸序列；(b)包含與SEQIDNO:l或SEQIDNO:2至少80%相同的 序列的分離的核苷酸序列；或(c)由(a)或(b)的分離的核苷酸序列編碼的多肽。 在一些實施方案中，分離的核酸序列是SEQIDNO:l或SEQIDNO:2。在另一方面，本公開描述分離的核酸，其含有(a)在高嚴緊條件下與 SEQ ID NO:l或SEQ ID NO:2的補體雜交的核苷酸序列；或(b)核苷酸序列的補體。 在又一方面，本公開提供(a)包含本文所示核酸序列中任一(或由其組 成)的分離的核苷S吏序列；(b)包含與本為所示的核酸序列中的任一至少80% 相同的序列的分離的核苷酸序列；或(c)由(a)或(b)的分離的核苷酸序列編碼 的多肽。在一些實施方案中，所迷分離的核酸序列是本文所示的核酸序列中 的任一。 在另一方面，本公開描述分離的核酸，其含有(a)在高嚴緊條件下與本 文所示核酸序列中任一的補體雜交的核苷酸序列；或(b)所述核芬酸序列的補體。 在又一方面，本公開提供(a)包含上述核酸序列中任一的載體或(b)含有 (a)的載體的經(jīng)培養(yǎng)的細胞。所述載體可以是表達載體。載體中的核酸序列可 以與表達調(diào)控序列可操作地連接。 在另一方面，本公開提供產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法。所述方法包括在允許多肽 表達的條件下培養(yǎng)上述細胞中的任一種的步驟。所述方法也可包括如下步 驟在培養(yǎng)細胞之后，從細胞或培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中分離多肽。所述細胞可 以是例如，含有包含上述核酸序列中任一的載體的經(jīng)培養(yǎng)細胞。 本文所述的目標分子(例如，目標蛋白)、具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)和 N-糖基化改變的分子(統(tǒng)稱為'本發(fā)明的分子')可以是，但不需要是分離的。 術(shù)語'分離的'如應(yīng)用于任何本文所述的本發(fā)明的分子是指這樣的分子或其 片段，其已經(jīng)從天然與其伴隨的成分(例如，蛋白質(zhì)或其它天然存在的生物 分子或有機分子)分開或純化。應(yīng)理解的是重組分子(例如，重組蛋白)將總是 '分離的'。通常，當本發(fā)明的分子按重量占制備物中全部相同類型的分子 的至少60%時，例如占樣品中全部相同類型的分子的60%時，則它是分離的。 例如，當糖基化改變的蛋白質(zhì)按重量占制備物或樣品中全部蛋白質(zhì)的至少 60%時，它是分離的。在一些實施方案中，制備物中的本發(fā)明的分子按重量 組成至少75%，至少90%，或至少99%的制備物中全部相同類型的分子。 如用于本文，目標分子的'改變的N-糖基化形式'是由經(jīng)遺傳工程化的宿 主細胞(例如，解脂西洋蓍霉細胞、Jnrw/fl ' 如用于本文，術(shù)語'其它相關(guān)的雙態(tài)性酵母細胞種類'是指與解脂西洋 著審和Jncw/a ac/em.m'v。raw相關(guān)的屬于雙足囊菌科(family Z^wc^wcacg'g)的 酵母，例如爿rjaJa、雙足嚢菌屬(Z)0o^^cws)(例如白色雙足嚢菌(D. a/6^/w'、 大雙足嚢菌CD. /wgem')、或i'/ eci/^)、半乳糖霉(Ga/fl'cwy/ce力(例如里氏 半乳凈唐霉(G re&s7./)或大；也半乳沖唐霉(G geo/n'c/zw/w》、iS^orap'c/^afer附fl、射盾 子嚢霉屬CSy甲/w'oascw力(例如，西非射盾子嚢霉(S. cz/en7))、擬威克酵母屬 (奶'c/:er/zamz'e〃a)和才妄嚢菌屬(ZygoascM力。具體而言,進4b4支M^c/w汰ovWa (例 如，Af. /3w/c/zew'/wa或M agaves)和射盾子嚢霉屬(通過分析菌種如(例 如A ac/em'mVoram或」.&/7^的》的26S-rDNA序歹'j的Dl/D2結(jié)構(gòu)域?qū)⒔庵?西洋蓍霉被分配于其中)中的酵母以及一些念珠菌屬菌種(Ca'WA species) (例如，C. ap/co/a，而非白念珠菌(C, a/6z'cara)、麥芽糖念珠菌(C. ma/tose)或 熱帶念珠菌(C. frap/cafc))。 '多肽，，和'蛋白質(zhì)，，可以互換使用并且意指任何肽連接的氨基酸鏈， 無論其長度和翻譯后修飾。 本公開還提供本文所述的野生型、全長、成熟'目標蛋白'或'具有 N-糖基化活性的蛋白質(zhì)，，的(i)生物學活性變體和(ii)生物學活性片段或其生物 學活性變體。全長、成熟、野生型蛋白質(zhì)或所述蛋白質(zhì)的片段的生物學活性 變體可以含有添加、缺失或取代。具有取代的蛋白質(zhì)將通常具有不多于50 個(例如，不多于l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 12、 15、 20、 25、 30、 35、 40或50個)保守氨基酸取代。保守取代是用一種氨基酸取代另一種具有 相似特征的氨基酸。保守取代包括在以下組內(nèi)的取代纈氨酸、丙氨酸和甘 氨酸；亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰 胺；絲氨酸、半胱氨酸和蘇氨酸；賴氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。 非極性疏水氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙 氨酸、色氨酸和曱硫氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、 半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電的(堿性)氨基酸包括精氨 酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。將上述極性、堿性或酸性組中的一個成員用相同組中的另一成員取代可認為是保 守取代。相反，非保守取代是用一種氨基酸取代另一種具有不相似的特征的 氨基酸的取代。 在夾失變體可以擊夾乏l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20個(兩個或更多個氨基酸的)氨基酸區(qū)段或不連續(xù) 的單獨氨基酸。 添力口(添加變體)包括融合蛋白，所述融合蛋白含有(a)全長、野生型、 成熟多肽或其含有至少五個氨基酸的片段；和(b)內(nèi)部或末端(C或N)的無關(guān) 的或異源的氨基酸序列。在這些融合蛋白的背景下，術(shù)語'異源氨基酸序列' 是指除(a)之外的氨基酸序列。因此含有本文描述的肽和異源氨基酸序列的融 合蛋白在序列上不對應(yīng)于天然存在的蛋白質(zhì)的全部或部分。例如，異源序列 可以是用于重組蛋白的純化的序歹U(例如，F(xiàn)LAG、多組氨酸(例如，六組氨酸)、 血凝素(hemagluttanin) (HA)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或麥芽糖結(jié)合蛋白 (MBP))。異源序列也可以是用作診斷或檢測標志物的蛋白質(zhì)，例如，螢光素 酶、綠色熒光蛋白(GFP)或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)。在一些實施方案中，融 合蛋白含有來自另一蛋白質(zhì)的信號序列。在某些宿主細胞(例如，酵母宿主 細胞)中，目標蛋白的表達和/或分泌可以通過使用異源信號序列增加。在一 些實施方案中，融合蛋白可以含有可用于例如引發(fā)免疫應(yīng)答(例如，用于抗 體生成；見下文)的載體(例如，KLH)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體保留信號。異源序 列可以具有不同的長度，并且在一些情況下可以是比異源序列所附接的全長 目標蛋白更長的序列。 '片段，，如用于本文是指比全長、不成熟的蛋白質(zhì)短的多肽的區(qū)段。蛋 白質(zhì)的片段可以具有末端(羧基或氨基末端)缺失和/或內(nèi)部缺失。通常，蛋白 質(zhì)的片段的長度將是至少4個(例如，至少5個、至少6個、至少7個、至 少8個、至少9個、至少10個、至少12個、至少15個、至少18個、至少 25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少50個、至少60個、至少 65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個或至少 IOO個或更多個)氨基酸。 目標蛋白或具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的生物學活性片段或生物學活 性變體具有野生型、全長、成熟蛋白質(zhì)的活性的至少25%(例如，至少30%; 40%; 50%; 60%; 70%; 75%; 80%; 85%;卯％; 95%; 97%; 98%; 99%; 1999.5%,或100%或甚至更高)。在目標蛋白的情況下，相關(guān)活性是目標蛋白 在經(jīng)遺傳工程化的細胞中經(jīng)歷改變的N-糖基化的能力。在具有N-糖基化活 性的蛋白質(zhì)的情況下，相關(guān)活性是N-糖基化活性。 依賴于它們的預(yù)期用途，蛋白質(zhì)、其生物學活性片段或生物學活性變體 可以是任何物種的，如，例如，真菌(包括酵母)、線蟲、昆蟲、植物、鳥、 爬行動物、或哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、兔、倉鼠、沙鼠(gerbil)、犬、 貓、山羊、豬、牛、馬、鯨、猴或人)。在一些實施方案中，生物學活性片 段或生物學活性變體包括所述蛋白質(zhì)的免疫原性和抗原性片段。免疫原性片 段是具有相關(guān)全長、未成熟蛋白質(zhì)在感興趣的動物中刺激免疫應(yīng)答(例如， 抗體應(yīng)答或細胞免疫應(yīng)答)的能力的至少25%(例如，至少30%; 40%; 50%; 60%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 97%; 98%; 99%; 99.5%或100% 或甚至更多)的片段。蛋白質(zhì)的抗原性片段是具有相關(guān)全長、未成熟的蛋白 質(zhì)被對于所述蛋白質(zhì)特異性的抗體或?qū)τ谒龅鞍踪|(zhì)特異性的T細胞識別 的能力的至少25%(例如，至少30%; 40%; 50%; 60%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 97%; 98%; 99%; 99.5%或100%或甚至更多)的片段。 'N-糖基化活性'如用于本文是指任何如下活性，即(i)能夠向目標分子添 加N-聯(lián)聚糖(即，寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性)；(ii)從目標分子去除N-聯(lián)聚糖，(iii) 修飾目標分子上的一個或多個N-聯(lián)聚糖，(iv)修飾多萜醇連接的寡糖；或(v) 能夠輔助(i-iv)之內(nèi)的活性的活性。同樣，N-糖基化活性包括，例如，N-糖苷 酶活性、糖芬酶活性、糖基轉(zhuǎn)移酶活性、糖核苷酸合成、修飾或轉(zhuǎn)運蛋白活 性。對目標分子上一種或多種N-聯(lián)聚糖的修飾包括甘露糖基磷?；D(zhuǎn)移酶 (mannosylphosphoryltransferase)活性、5敫酶活性或石舞酸酶活性，例如，改變 目標分子上N-聯(lián)聚糖的磷酸化狀態(tài)的甘露糖基磷?；D(zhuǎn)移酶、激酶或磷酸 酶活性。 如用于本文，'遺傳工程化'細胞或'經(jīng)遺傳工程化的細胞'和類似術(shù) 語是指任何人工創(chuàng)造的細胞的遺傳改變，其導(dǎo)致與未經(jīng)遺傳工程化的細胞 (例如，真菌細胞例如解脂西洋蓍霉細胞、^nrw/a acfem'm'vora's細胞或其它相 關(guān)種類的雙態(tài)性的酵母細胞，植物細胞或動物細胞(例如，哺乳動物細胞例 如人的細胞))相比細胞中的至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性。由此，應(yīng)該理 解的是人工創(chuàng)造的遺傳改變不包括，例如，自發(fā)突變。人工遺傳改變的實例 在下文描述(參見'遺傳工程化的細胞，，)。如用于本文，術(shù)語'野生型'如應(yīng)用于核酸或多肽是指當生物學生物體 產(chǎn)生的核酸或多肽。 術(shù)語'異源，，如在本文中應(yīng)用于宿主細胞中的核酸或由宿主細胞產(chǎn)生的 多肽是指并非源自與宿主細胞相同種類的細胞的核酸或多肽(例如，具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì))。因此，如用于本文，'同源，，核酸或蛋白質(zhì)是在與宿些。 術(shù)語'外源，，如用于本文與核酸和特定宿主細胞有關(guān)時是指不存在于(并 且不能獲得自)在自然界中存在的所述特定細胞的任何核酸。因此，非天然 存在的核酸一旦引入宿主細胞則被認為對于所述宿主細胞是外源的。重要的 是應(yīng)注意非天然存在的核酸可以含有在自然界中存在的核酸序列的核酸亞 序列或片段，條件是所述核酸作為整體不存在于自然界中。例如，在表達載 體內(nèi)含有基因組DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，并且因此一旦 引入宿主細胞則對所述宿主細胞是外源的，因為該核酸分子作為整體(基因 組DNA加上載體DNA)不存在于自然界中。因此，作為一個整體在自然界 中不存在的任何載體、自復(fù)制質(zhì)?；虿《?例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或皰 滲病毒)被認為是非天然存在的核酸。由此推斷通過PCR或限制性內(nèi)切核酸 酶處理的基因組DNA片段以及cDNA被認為是非天然存在的核酸，因為它 們作為在自然界中不存在的單獨的分子而存在。還由此推斷以自然界中不存 在的排列含有啟動子序列和多肽編碼序列的任何核酸是非天然存在的核酸。 天然存在的核酸對于特定細胞可以是外源的。例如，從酵母x的細胞分離的 完整染色體一旦引入酵母y的細胞則該染色體對于酵母y的細胞是外源核 酸。 從上文將顯而易見的是，'外源'核酸可以是'同源'或'異源，，核酸。 相反，術(shù)語'內(nèi)源'如用于本文與核酸或基因(或由所述核酸或基因編碼的 蛋白質(zhì))以及特定細胞有關(guān)時是指確實存在于(并且可以獲得自)在自然界中 存在的所述特定細胞中。 作為對上述概念的示例，轉(zhuǎn)化入解脂西洋蓍霉細胞中的編碼解脂西洋蓍 霉ALG6蛋白的表達質(zhì)粒相對于該細胞而言是外源核酸。然而，編碼ALG6 蛋白的序列和由其產(chǎn)生的ALG6蛋白與所述細胞是同源的。類似地，轉(zhuǎn)化入 21解脂西洋蓍霉細胞中的編碼a血w'mVorara ALG6蛋白的表達質(zhì)粒相對于該細胞而言是外源核酸。然而與前一例子相反，編碼所述ALG6蛋白的序列和由其產(chǎn)生的ALG6蛋白與所述細胞是異源的。 如用于本文，'啟動子'是指使基因能夠被轉(zhuǎn)錄的DNA序列。啟動子由RNA聚合酶識別，然后起始轉(zhuǎn)錄。因此，啟動子含有或者直接通過RNA聚合酶的募集結(jié)合的或在RNA聚合酶的募集中涉及的DNA序列。啟動子序列也可以包括'增強子區(qū)，，，其是能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合以增強基因簇中基因的轉(zhuǎn)錄水平(因此得名)的一個或多個DNA區(qū)(即，反式作用因子，更像一組轉(zhuǎn)錄因子)。所述增強子盡管通常在編碼區(qū)的5，端，但是也可以與啟動子序列分開，并且可以例如在基因內(nèi)含子區(qū)內(nèi)或在基因編碼區(qū)的3，。 如用于本文，'可操作地連接，，是指并入遺傳構(gòu)建體從而表達調(diào)控序列有效地調(diào)控感興趣的編碼序列的表達。 本文描述的任何核酸序列的變體(例如，SEQ ID NO:l或SEQ ID NO:2中所示的HAC1序列)可以具有與野生型核酸序列同源的序列，例如，與野生型核酸序列為至少約70%(例如，至少約75%，至少約80%,至少約85%，至少約卯％，至少約95%或至少約99%)同源(相同)的序列。這4f的野生型序列可以分離自自然界或者可以通過重組或合成方法產(chǎn)生。由此野生型序列核酸可以具有天然存在的人的核酸序列、猴核酸序列、鼠類核酸序列或任何其它含有所述感興趣野生型核酸的同源物的物種的核酸序列。如用于本文，'同源'或'同源核酸序列'或類似術(shù)語是指如下序列，其特征在于在核苷酸水平的至少指定百分比的同源性，并且可與序列同 一性互換使用。 百分比同源性或同一性可以如下測定，例如通過Gap程序(WisconsinSequence Analysis Package,用于UNIX的第八版，Genetics Computer Group,University Research Park, Madison, WI)，使用缺省設(shè)定，其j吏用Smith和Waterman ((1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489)的算法。在一些實施方案中，探針和靶(見下文)之間的同源性在約50%至約60%之間。在一些實施方案中，探針和耙核酸之間的同源性是大約55%-65%， 65%-75%,約70%-80%，約75%-85%,約80%-90%,約85%-95%或約90%-100%。 術(shù)語'探針，，如用于本文是指長度可變的核酸序列。在一些實施方案中， 探針包含至少io個并且多如6,00o個核苷酸序列。在一些實施方案中，^:針 包含至少12個，至少14個，至少16個，至少18個，至少20個，至少25個，至少50個或至少75個或100個連續(xù)核苷酸。較長長度的探針通常獲得自天然或重組的來源(與直接的化學合成相反)，對于靶序列是高特異性的，并且與較長的寡聚物相比與靶雜交慢得多。探針可以是單鏈或雙鏈核酸分子。 在一些實施方案中，本文描述的變體核酸可以具有如下序列，所述序列包含與感興趣的野生型核酸(例如，如SEQ ID N0:1或SEQ ID NO:2中所示的HAC1核酸序列)中的區(qū)域、部分、結(jié)構(gòu)域或區(qū)段具有部分互補性(例如，至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少卯％、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%互補性)的單鏈或雙鏈。在一些實施方案中，感興趣的變體核酸序列可以具有如下序列，所述序列包含與野生型核酸序列中的區(qū)域、部分、結(jié)構(gòu)域或區(qū)段具有完全互補性(即，100%互補性)的單鏈或雙鏈。序列'互補性'是指特定含氮堿基之間由于它們的氫鍵鍵合特性(即，具有使反向平行雙鏈體能夠形成的^5威基序列的兩條核酸鏈的性質(zhì)，其中腺噤呤和尿嘧啶(或胸腺嘧啶，在DNA或經(jīng)修飾的RNA的情況下)4皮此相反，而鳥嘌呤和胞嘧咬彼此相反)產(chǎn)生的化學親和力。如此，完全互補序列將是在核苷酸序列形成反向平行雙鏈體時具有完全的 一對一44基序列對應(yīng)性(即，腺噪呤對尿嘧啶/胸腺嘧啶且鳥噪呤對胞嘧啶)的兩個序列。 雜交也可用作對兩個核酸序列之間同源性的測量。本文描述的核酸序列，或其片段或變體，可以用作依據(jù)標準雜交技術(shù)的雜交探針。感興趣的特定探針(例如，HAC1核苷酸序列的探針，例如，如SEQIDNOS:l或2中所示的HAC1核苷S臾序列)與來自試驗來源(例如，真核細胞)的DNA或RNA的雜交表明對在試驗來源中對應(yīng)于所述探針的DNA或RNA的存在(例如，HAC1核香酸序列)。雜交條件是本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的，并且可以在Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6,1991中找到。將中等雜交條件定義為等同于在2X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在30。C雜交，之后在IXSSC、 0.1%SDS中在50。C清洗。將高嚴緊性條件定義為等同于在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在45°C雜交，之后在0.2 X SSC、0.1% SDS中在65。C清洗。 除非另有限定，本文使用的全部技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的一個普通技術(shù)人員所通常理解的相同的含義。盡管在本發(fā)明的實踐或測試中可以使用與本文描述的那些相似的或等同的方法和材料，在下文將描述示例性的方法和材料。將本文提及的全部^^開文獻、專利申請、專利、Genbank 登錄號和其它參考文獻通過所述整體并入。發(fā)生沖突的情況下，以包括定義在內(nèi)的本申請為準。材料、方法和實例僅作為示例說明，而非意欲進行限制。 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢，例如，產(chǎn)生N-糖基化改變的分子的方法，將從以下詳述并從權(quán)利要求書中清楚可見。 附圖簡述 附圖說明  圖1是描述在酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的N-聚糖前體合成的示意圖。其所編碼的蛋白質(zhì)具有介導(dǎo)指明的酶促轉(zhuǎn)化的活性的基因在帶陰影的框中(例如，ALG7;左上)。'UDP'和'UMP'分別指二磷酸尿普和一磷酸尿苷。'GDP'和'GMP'分別指二磷酸鳥苷和一磷酸鳥苷。'Gn'是指N-乙酰葡糖胺。'M'是指單體甘露糖，G是指葡萄糖，Pi是指磷酸。 圖2是描述酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中N-聚糖加工的示意圖。 圖3是描述釀酒酵母0S. cerevWae)高爾基體中N-聚糖加工的示意圖。其編碼的蛋白質(zhì)具有介導(dǎo)指明的酶促轉(zhuǎn)化的活性的基因在帶陰影的框中(例如，0CH1;中上)。 圖4是描述多種本文所述的N-聚糖結(jié)構(gòu)的示意圖。 圖5是描述用于破壞解脂西洋蓍霉中0CH1基因的克隆策略的示意圖。'PCR'是指聚合酶鏈式反應(yīng)。 圖6是描述用于MNN9基因破壞片段的克隆策略的示意圖。'PCR'是指聚合酶鏈式反應(yīng)。 圖7是一系列描述獲得自野生型解脂西洋蓍霉細胞或糖基化突變體(例如，Aochl c19、 Amnn9 1和Aochl Amnn9)細胞和MTLY60菌林細胞的甘露糖蛋白的N-聚糖分析的電泳圖譜(dectroferogram)。在一些情況下，將所述N-聚糖進一步用a-l,2甘露糖苷酶處理。使用DNA測序儀輔助型、熒光團輔助型糖電泳(DSA-FACE)來進行分析。'M5', 'M6', 'M7'， 'M8'，和'M9'是指與基本N-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)結(jié)合(conjugate)的甘露糖殘基數(shù)。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖(oligomaltose)的分析。 圖8是描述用于釀酒酵母MNS1表達載體的克隆策略的示意圖。'PCR'是指聚合酶鏈式反應(yīng)。 圖9是一系列描述對獲得自MTLY60細胞的分泌型糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜，所述細胞表達野生型(WT) Mnslp或所指明的Mnslp的多種突變形式(即，R273G、 R273L或R269S/S272G/R273L)。分析使用I)SA-FACE進行。'M5', 'M6', 'M7'， 'M8', 'M9，，是指與基本N-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)結(jié)合的甘露糖殘基數(shù)。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。 圖10是描述用于MNN4表達載體的克隆策略的示意圖。圖11是一系列描述對獲得自指明的野生型MTLY60細胞或糖基化突變細胞的分泌型糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進行。'M5'， 'M6'， 'M7', 'M8'， 'M9'是指與殼二糖核心結(jié)構(gòu)結(jié)合的甘露糖殘基數(shù)。'P，，是指含有一個磷酸殘基的甘露糖蛋白，而'PP'是指含有兩個磷酸殘基的甘露糖蛋白。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。 圖12是描述用于a-半乳糖苷酶表達載體的克隆策略的示意圖。圖13是一系列描述對獲得自指明的野生型MTLY60細胞或糖基化突變細胞的多種克隆的甘露糖蛋白和磷酸甘露糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。'alg3，，表明所述細胞是ALG3敲除型。'ALG6過表達'表明所述ALG6的蛋白質(zhì)產(chǎn)物在細胞中過表達。分析使用DSA-FACE進行。'M5，，， 'M6，，，'M7'， 'M8，，和'M9，，是指與基本N-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)結(jié)合的甘露糖殘基數(shù)。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過聚丙烯酰胺凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。 圖14是一系列描述對獲得自指明的野生型MTLY60細il包或糖基化突變細胞的多種克隆的甘露糖蛋白和磷酸甘露糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。'alg3，，表明所述細胞是ALG3敲除型。'ALG6過表達'表明所述ALG6的蛋白質(zhì)產(chǎn)物在細胞中過表達。 一個峰與RNA酶B標志物的Man5GlcNAc2運行在相同位置，并且在a-l，2-甘露糖苷酶處理之后遷移了兩個葡萄糖單位，并在(x-甘露糖苷酶(JB)消化之后遷移4個葡萄糖單位。這與預(yù)期的 25Man5GlcNAc2結(jié)構(gòu)相符。額外的兩個峰在約 一個和兩個糖單位的距離運行， 并且不受a-l,2-甘露糖苷酶消化的影響。在a-甘露糖苷酶(JB)消化時兩個峰 都遷移一個葡萄糖單位。小遷移是因為加入的酶(例如JB甘露糖苷酶)的較高 的鹽濃度。分析使用DSA-FACE進行。'M5'， 'M6'， 'M7'， 'M8'和'M9' 是指與殼二糖核心結(jié)構(gòu)結(jié)合的甘露糖殘基數(shù)。Y軸代表相對焚光單位，表明 各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移 率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。 圖15是對獲得自未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答(UPR)誘導(dǎo)的菌抹解脂西洋蓍霉的 分離的DNA片段(SEQ ID NO:l)序列與基因組HACl DNA序列(SEQ ID NO:5)的序列比對。帶框的序列對應(yīng)于非常規(guī)剪接的內(nèi)含子。 圖16是一系列對巴斯德畢赤酵母和釀酒酵母的預(yù)測的5'(頂部)和3，(底 部)剪接位點的序列比對。粗體加下劃線的核苷酸存在于環(huán)結(jié)構(gòu)中。 圖17A和17B是對獲得自DTT-誘導(dǎo)型(I) (SEQ ID NO:2)和非誘導(dǎo)型(NI) (SEQ ID NO:6)巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物的HAC1 cDNA的序列比對的兩個部 分視圖。 圖18是對巴斯德畢赤酵母和釀酒酵母18個氨基酸的C-末端區(qū)域的序列 比對。保守的氨基酸為粗體并加下劃線。 圖19是描述對KAR2 mRNA的相對表達水平進行比較的柱狀圖。將克 隆3、 4和5 (巴斯德畢赤酵母GSM5細胞)在作為碳源的曱醇上培養(yǎng)。'3+'、 '4+'和'5+，，是指在作為碳源的曱醇上培養(yǎng)的各個克隆，而'3-'、 '4-'和'5_'是 指在作為碳源的葡萄糖上培養(yǎng)的各個克隆。Y軸代表使用實時PCR的KAR2 基因的相對表達。 圖20是描述兩種巴斯德畢赤酵母克隆(克隆6和8)中Kar2和HAC1的 相對表達水平的柱狀圖。'6+，，和'8+，，是指在作為碳源的曱醇上培養(yǎng)的各個克 隆，而'6-，，和'8-'是指在作為碳源的葡萄糖上培養(yǎng)的各個克隆。Y軸代表使 用實時PCR的KAR2基因的相對表達。 圖21是描述用于Y1MNN6表達載體的克隆策略的示意圖。 圖22是一系列描述對獲得自指明的單獨的Aochl解脂西洋蓍霉細胞， 或表達Y1MNN6的Aochl解脂西洋蓍霉的多種克隆(Z3、 Z4、 Z5、 U5、 U6 和U8)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進行。 Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡 麥芽糖的分析。 圖23是描述用于MFManHDEL表達載體的克隆策略的示意圖。 圖24是一系列描述對獲得自指明的單獨的Aochl解脂西洋蓍霉細胞， 或表達MFManHDEL的Aochl解脂西洋蓍霉的多種克隆(9、 11、 10、 3、 5 和6)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進行。 Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露 糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡 麥芽糖的分析。 圖25是描述用于LIP2preManHDEL表達載體的克隆策略的示意圖。 圖26是一系列描述對獲得自指明的單獨的Aochl解脂西洋蓍霉細胞， 或表達LIP2ManHDEL的Aochl解脂西洋蓍霉的多種克隆(l、 5、 10和11) 的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進行。'M5'， 'M6', 'M7'， 'M8'和'M9'是指與殼二糖核心結(jié)構(gòu)結(jié)合的甘露糖殘基數(shù)。Y 軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖 結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥 芽糖的分析。 圖27A和27B是解脂西洋蓍霉(圖27A; SEQ ID NO:3)和巴斯德畢赤酵 母(圖27B; SEQ ID NO:4)的HAC1蛋白的氨基酸序列。 圖28是考馬斯藍染色的聚丙烯酰胺凝膠的照片，其描述在多種解脂西 洋蓍霉細胞(MTLY60、MTLY60Aa/g3和MTLY60Aa/gWZG6)培養(yǎng)物中Lip2p 過表達的結(jié)果。在凝膠中解析了以下樣品泳道l ('梯子'或'梯')，已 知分子量的蛋白質(zhì)的組合；泳道2('WT')，獲得自過表達Lip2p的WT解脂 西洋蓍霉細胞(MTLY60)的Lip2p蛋白；泳道3 ('WT+PGase F，)，獲得自過 表達Lip2p的WT解脂西洋蓍霉細胞并用PNGase F酶處理的Lip2p蛋白； 泳道4 ('alg3-ALG6'),獲得自缺乏alg3并且過表達Lip2p和ALG6 二者的 西洋蓍霉細胞(MTLY60Aa/g^4丄G6)的 Lip2p 蛋白；泳道 5 ('alg3-ALG6+PNGase F,)，獲得自缺乏alg3并且過表達Lip2p和ALG6 二者 的西洋蓍霉細胞(MTLY60A'/g3/^G'6)并且用PNGase F酶處理的Lip2p蛋白； 泳道6 ('alg3，，)，獲得自缺乏alg3并且過表達Lip2p的解脂西洋蓍霉細胞 (MTLY60Aa/g3)的Lip2p蛋白；泳道7 ('alg3 + PNGase F'),獲得自缺乏alg3并且過表達Lip2p的解脂西洋蓍霉細胞(MTLY60Aalg3)并用PNGase F酶處理 的Lip2p蛋白；泳道8 ('無Lip2p過表達的WT'),獲得自MTLY60細胞的 蛋白質(zhì)；和泳道9 ('無Lip2p過表達的WT + PNGase F')，獲得自MTLY60 細胞并用PNGase F酶處理的蛋白質(zhì)。 圖29是一系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍霉細胞(WT (MTLY60); Aalg3; Aalg3 ALG6過表達的；和過表達ALG6連同來自解脂西 洋蓍霉(Yl)或布氏錐蟲(Tb)的葡糖苷酶II的a亞基的Aalg3克隆)的糖蛋白進 行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進行。'M5'，'M6','M7'， 'M8'和'M9'是指與殼二糖核心結(jié)構(gòu)結(jié)合的甘露糖殘基數(shù)。Y軸代表相對熒 光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝月交 的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。 底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。 圖30是一系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍霉細胞(Aalg3; Aalg3 ALG6過表達的；和過表達ALG6連同含有HDEL序列的來自解脂西 洋蓍霉(Y1)的葡糖苷酶II的a亞基的Aalg3克隆)的糖蛋白進行的N-聚糖分 析的電泳圖語。分析使用DSA-FACE進行。Y軸代表相對熒光單位，表明各 個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。 圖31是一系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍霉細胞(Aalg3; Aalg3 ALG6過表達的；和過表達ALG6連同含有HDEL序列的來自布氏錐 蟲(ro;p朋仍oma ^mc&) (Tb)的葡糖苷酶II的a亞基的Aalg3克隆)的糖蛋白 進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進行。Y軸代表相對 熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝 膠的相對遷移率。 圖32是一系列描述對獲得自指明的用不同濃度變聚糖酶體外處理的 alg3ALG6解脂西洋蓍霉細胞的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析 使用DSA-FACE進行。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。 X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對 用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分 析。 圖33是一系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍霉細胞(Aalg3; Aalg3 ALG6過表達的；和過表達ALG6連同在Hp4d或TEF啟動子調(diào)控下表達的來自解脂西洋蓍霉(Y丄)的葡糖苷酶II的a亞基和來自Y.l的葡糖苷酶 II的(3亞基的Aalg3克隆)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。Y軸代 表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu) 通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖 的分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。 圖34是一 系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍霉細胞(Aalg3 ALG6 過表達的；和過表達ALG6連同在Hp4d或TEF啟動子調(diào)控下表達的含HDEL 的來自解脂西洋蓍霉(Y.1.)的葡糖香酶II的a亞基和來自Y.l的葡糖苷酶II的 (3亞基的Aalg3克隆)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用 DSA-FACE進行。Y軸代表相對焚光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸 代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作 遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。 圖35是一系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍霉細胞(Aalg3和過 表達在TEF啟動子調(diào)控下表達的來自解脂西洋蓍霉(Y.1.)的葡糖苷酶II的a 亞基和來自Y.l的葡糖苷酶II的卩亞基的Aalg3克隆)的糖蛋白進行的N-聚糖 分析的電泳圖譜。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸 代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作 遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。 圖36A和36B描述的是編碼黑曲霉C^p^^〃w m'gw)葡糖苷酶II q成熟 形式(缺少信號肽)的cDNA的核苷酸序列，其是為了在解脂西洋蓍霉中表達 而經(jīng)密碼子優(yōu)化的cDNA(SEQ IDN0:7)。 圖37是描述編碼黑曲霉(v^; wgz7/^ m'gw)葡糖苷酶II卩成熟形式(缺少信 號肽)的cDNA的核苷酸序列，其是為了在解脂西洋蓍霉中表達而經(jīng)密碼子 優(yōu)化的cDNA (SEQ ID NO: 8)。 圖38是一系列對獲得自指明的多種解脂西洋蓍霉細胞(Aalg3和ALG6 過表達的，連同在TEF或hp4d啟動子調(diào)控下表達的來自黑曲霉(An)的葡糖 香酶II的a亞基)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。Y軸代表相對熒 光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠 的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。 底部的電泳圖鐠是對RNA酶B的分析。 圖39A和39B是一對柱狀圖，其描述在WT (MTLY60)解脂西洋蓍霉細胞中或在含有在hp4d啟動子表達調(diào)控下的HACl cDNA的經(jīng)剪接形式的解 脂西洋蓍霉細胞的兩個克隆(克隆7和克隆2)中，HAC1 (39A)或KAR (39B) 基因的相對表達水平(Y軸)。 圖40是線型圖，其描述用空載體轉(zhuǎn)化的野生型巴斯德畢赤酵母GS115 細胞與表達Haclp蛋白的巴斯德畢赤酵母GS115細胞的生長相比的生長。 圖41是考馬斯藍染色的聚丙烯酰胺凝膠的照片，其比較了來自表達鼠 類IL-10 (mlL-10)蛋白的巴斯德畢赤酵母GS115細月包細胞培養(yǎng)物的mIL-lO 蛋白的表達水平與獲得自在誘導(dǎo)型啟動子AOX1調(diào)控下表達mIL-lO和來自 巴斯德畢赤酵母的經(jīng)剪接HAC1蛋白的GS115細胞的培養(yǎng)物的mlL-10蛋白 的表達。在凝膠中解析了以下樣品泳道l ('梯子')，已知分子量的蛋白 質(zhì)的組合；泳道2 ('參照，，)，獲得自表達參照mIL-lO的巴斯德畢赤酵母菌抹 (GS115)的蛋白質(zhì)；泳道3 ('參照')，獲得自表達參照mIL-lO的巴斯德畢赤 酵母菌抹的、在用PNGaseF酶處理蛋白質(zhì)之后的蛋白質(zhì)；泳道4('克隆l')， 獲得自誘導(dǎo)型表達HAC1蛋白的表達mIL-10的巴斯德畢赤酵母細胞的蛋白 質(zhì)；泳道5('克隆1')，荻得自誘導(dǎo)型表達HAC1蛋白的表達mIL-lO的巴斯 德畢赤酵母細胞的、在用PNGaseF酶處理蛋白質(zhì)之后的蛋白質(zhì)；泳道6 ('克 隆2')，獲得自誘導(dǎo)型表達HAC1蛋白1的表達mIL-10的巴斯德畢赤酵母細 胞的蛋白質(zhì)；泳道7 ('克隆2')，獲得自誘導(dǎo)型表達HAC1蛋白的表達mIL-10 的巴斯德畢赤酵母細胞的、在用PNGaseF酶處理蛋白質(zhì)之后的蛋白質(zhì)。 圖42描述的是編碼里氏木霉(7Hc/706few7a a-l，2甘露糖苷酶、為 了在解脂西洋蓍霉中表達而經(jīng)密碼子優(yōu)化、含有LIP2前信號序列的示例性 cDNA序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:9)。 圖43描述的是用于解脂西洋蓍霉的GAP啟動子的示例性核苷酸序列的 核苷酸序列(SEQ ID NO: 10)。 圖44A-44C描述的是用于表達載體pYLHUXdL2preManHDEL的示例性 核苷酸序列(SEQ ID NO:ll)，其含有編碼里氏木霉a-1,2甘露糖苷酶的、為 了在解脂西洋蓍霉中表達而經(jīng)密碼子優(yōu)化并且含有LIP2前信號序列的 cDNA序列。 圖45A-45C描述的是用于表達載體pYLGUXdL2preManHDEL的示例性 核苷酸序列(SEQ ID NO:12)，其含有編碼里氏木霉a-l，2甘露糖苷酶的、為 了在解脂西洋蓍霉中表達而經(jīng)密碼子優(yōu)化并且含有LIP2前信號序列的 30200880018736.4 cDNA序列。 圖46A-46C描述的是用于表達載體pYLPUXdL2preManHDEL的示例性 核苷酸序列(SEQ ID NO:13)，其含有編碼里氏木霉a-l,2甘露糖苷酶的、為 了在解脂西洋蓍霉中表達而經(jīng)密碼子優(yōu)化并且含有LIP2前信號序列的 cDNA序列。 圖47A-47C描述的是用于表達載體pYLTUXdL2preManHDEL的示例性 核苷酸序列(SEQ ID NO:14),其含有編碼里氏木霉a-l,2甘露糖苷酶的、為 了在解脂西洋蓍霉中表達而經(jīng)密碼子優(yōu)化并且含有LIP2前信號序列的 cDNA序列。 圖48是一系列對獲得自用指明的不同表達載體轉(zhuǎn)化的解脂西洋蓍霉細 胞的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜'hp4dL2ManHDEL' (pYLHUXdL2preManHDEL ， 圖 44A-44C) ; 'GAPL2ManHDEL，， (pYLGUXdL2preManHDEL ， 圖 45A-45C) ; 'TEFlL2ManHDEL' (pYLTUXdL2preManHDEL，圖47A-47C)。 Y軸代表相對熒光單位，表明各 個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。 頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的葡聚糖(dextran)的分析。系列中第 二個電泳圖鐠是對RNA酶B的分析。 圖49是 一 系列對獲得自含有穩(wěn)定整合的表達載體 pYLTUXdL2preManHDEL (圖47A-47C)的解脂西洋蓍霉MTLY60 Aoc/z/細胞 的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。糖蛋白樣品獲得自24、 48、 72和 96小時的細胞培養(yǎng)物。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的葡聚糖 (dextran)的分析。系列中第二個電泳圖譜是對RNA酶B的分析。 圖50是用于人葡糖腦苷酯酶的示例性核酸序歹'](GLCM， Swiss Prot條目 號P04062; SEQ ID NO:15),其是按照為了在解脂西洋蓍霉中表達而經(jīng)密 碼子優(yōu)化的cDNA以化學方法合成的。 圖51是免疫印跡的照片，其描述了在解脂西洋蓍霉菌林MTLY60 (WT; 泳道4和6)和MTLY60AocW (Aochl;前三個泳道)中表達的人葡糖腦苷酯酶 的遷移圖。蛋白質(zhì)的分子量(kDa)通過在所述免疫印跡最右側(cè)的分子量標志 物來說明。 圖52是人促紅細胞生成素的示例性核酸序歹'J(Epo, Swiss Prot條目號 P01588; SEQIDNO:16)，其是按照為了在解脂西洋蓍霉中表達而經(jīng)密碼子 31優(yōu)化的CDNA以化學方法合成的。 圖53是人a-半乳糖香酶A的示例性核酸序列(AGAL, Swiss Prot條目 號P06280; SEQ ID NO:17)，其是按照為了在解脂西洋蓍霉中表達而經(jīng)密 碼子優(yōu)化的cDNA以化學方法合成的。 圖54是一系列過表達Haclp蛋白的經(jīng)剪接形式的巴斯德畢赤酵母細胞 或野生型巴斯德畢赤酵母細胞的電子顯微照片。將細胞中堆疊的脂質(zhì)膜的離 散區(qū)加框。 圖55是一系列電泳圖譜，其描述對獲得自指明的WT解脂西洋蓍霉細 胞(polld)和表達a-l，2-甘露糖芬酶和HDEL序列的融合蛋白的解脂西洋蓍霉 細胞的糖蛋白進行的N-聚糖分析。分析使用DSA-FACE進行。'M5'， 'M6'， 'M7'， 'M8'和'M9'是指與殼二糖核心結(jié)構(gòu)結(jié)合的甘露糖殘基數(shù)。Y軸代表 相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通 過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的 分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。 詳述 本文描述的方法和遺傳工程化的細胞可以用于產(chǎn)生如下目標分子(例 如，目標蛋白或目標多萜醇)，其與在未經(jīng)遺傳工程化的細胞中產(chǎn)生的所述 目標分子的N-糖基化形式相比具有改變的N-糖基化形式。已經(jīng)證明糖基化 目標分子(例如，糖基化蛋白)向患有代謝紊亂(例如，溶酶體貯積病)患者的 施用使所述病癥的癥狀改善。因此，所述的方法和細胞可用于制備N-糖基 化改變的目標分子，其用于包括但不限于治療代謝紊亂如溶酶體貯積病。這 樣的N-糖基化改變的分子也可用于廣泛多樣的其它領(lǐng)域，例如，食品和飲 料工業(yè)；藥物工業(yè)(例如，作為疫苗)；農(nóng)業(yè)工業(yè)；和化學工業(yè)，等等。 N-糖基化改變的分子 如用于本文，目標分子是指通過來自遺傳工程化的細胞(例如，真菌細 胞；植物細胞；或動物細胞)的一種或多種N-糖基化活性而經(jīng)受改變的N-糖 基化的任何分子。在一些實施方案中，目標分子能夠^皮運輸經(jīng)過解脂西洋蓍或多步，導(dǎo)致它們的N-糖基化因宿主細胞機構(gòu)(machinery)而改變。所述目標 分子可以是內(nèi)源或外源的。 述含有添加、缺失或取代的蛋白質(zhì)。合適的目標蛋白包括病原體蛋白(例如， 破傷風類毒素；白喉(diphtheria)類毒素；病毒表面蛋白(例如，巨細胞病毒 (CMV)糖蛋白B、 H和gCIII;人免疫缺陷病毒1 (HIV-1)包膜糖蛋白；勞斯 肉瘤病毒(RSV)包膜糖蛋白；單純皰瘆病毒(HSV)包膜糖蛋白；EB病毒(EBV) 包膜糖蛋白；水痘帶狀皰滲病毒(VZV)包膜糖蛋白；人乳頭狀瘤病毒(HPV) 包膜糖蛋白；流感病毒糖蛋白；和肝炎家族表面抗原)，溶酶體蛋白(例如， 葡糖腦苦酯酶、腦苷酶或半乳糖腦香酯酶)，胰島素，胰高血糖素，生長因 子，細胞因子，趨化因子，抗體及其片段，或所述蛋白質(zhì)中任一與抗體或抗 體片段的融合物(例如，蛋白質(zhì)-Fc)。生長因子包括，例如，血管內(nèi)皮生長因 子(VEGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、粒細胞集落 刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、神經(jīng)生長因子 (NGF);神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、血小板衍生生長因子(PDGF)、促紅細胞生成素(EPO)、 血小板生成素(TPO)、 Myostatin (GDF-8)、生長分化因子-9 (GDF9)、堿性成 纖維細胞生長因子(bFGF或FGF2)、表皮生長因子(EGF)、肝細胞生長因子 (HGF)。細胞因子包括，例如，白介素(例如，IL-1至IL-33 (例如，IL-1 、 IL-2 、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-IO、 IL-12、 IL-13或IL-15))。 趨化因子包括，例如，1-309、 TCA-3、 MCP-1、 MIP-lou MIP-1卩、RANTES、 CIO、 MRP-2、 MARC、 MCP-3、 MCP-2、 MRP-2、 CCF18、 MIP-ly、 Eotaxin、 MCP-5、 MCP-4、 NCC-1、 CkpiO、 HCC-1、白細胞誘素-1 (Leukotactin-l)、 LEC、 NCC-4、 TARC、 PARC或Eotaxin-2。還包括腫瘤糖蛋白(例如，腫瘤 相關(guān)抗原)，例如，癌胚抗原(CEA)、人粘蛋白、HER-2/neu和前列腺特異性 抗原(PSA) [R. A. Henderson和0. J. Finn, Advances in Immunology, 62，第 217-56頁(1996)]。在一些實施方案中，目標蛋白可以是與溶酶體貯積病相關(guān) 的目標蛋白，所述目標蛋白包括，例如，a-L-艾杜糖苷酸酶、P-D-半乳糖苷 酶、|3-葡糖苷酶、(3-己糖胺酶、(3-D-甘露糖苷酶、a-L-巖藻糖苷酶、芳基硫 酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、 a-N-乙酰半乳糖胺酶、天冬氨酰葡糖胺酶、艾 杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、a-氨基葡糖苷-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、(3-D-葡糖醛酸酶、透 明質(zhì)酸酶、a-L-甘露糖苦酶、a-神經(jīng)氨酸酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、酸性脂肪酶、酸性神經(jīng)酰胺酶、鞘磷脂酶、硫酯酶、組織蛋白酶K和脂蛋白脂肪酶。 目標蛋白也可以是融合蛋白。融合蛋白包括，例如，(i)本文描述的任何 蛋白或其片段與(ii)抗體或其片段的融合物。如用于本文，術(shù)語'抗體片段' 是指抗原結(jié)合片段，例如，F(xiàn)ab、 F(ab')2、 Fv和單鏈Fv (scFv)片段。scFv片 段是單一多肽鏈，其包括所述scFv所源自的抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)二者。 此外，雙抗體[Poljak (1994) Structure 2(12):1121-1123; Hudson等(1999) J. Immunol. Methods 23(1-2): 177-189，將這兩篇的內(nèi)容通過所述整體并入本文] 和細胞內(nèi)抗體[Huston等(2001) Hum. Antibodies 10(3-4): 127-142; Wheeler等 (2003) Mol. Ther. 8(3):355-366; Stocks (2004) Drug Discov. Today 9(22): 960-966,將全部這些的內(nèi)容通過所述整體并入本文]也可以在本發(fā)明的方法 中使用。 目標蛋白也可以與聚合物、載體、佐劑、免疫毒素或可檢測的(例如， 焚光、發(fā)光或放射性)模塊中的一種或多種結(jié)合。例如，可以將目標蛋白與 聚乙二醇結(jié)合，所述聚合物模塊可以用于例如增加小蛋白質(zhì)的分子量和/或增 加循環(huán)滯留期。 在一些實施方案中，目標分子可以是或可以含有多萜醇。 遺傳工程化的細胞 本文描述的遺傳工程化的細胞具有至少 一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性， 所述細胞可用于一種或多種具有改變的N-糖基化形式的目標分子的產(chǎn)生。 適合于遺傳工程化的細胞包括，例如，真菌細胞(例如，解脂西洋蓍霉或本 文所述的任何其它相關(guān)的雙態(tài)性酵母細胞)，植物細胞或動物細胞(例如，(線 蟲、昆蟲、植物、鳥、爬行動物、或哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、兔、倉 鼠、沙鼠、犬、貓、山羊、豬、牛、馬、鯨、猴或人))。所述細胞可以是原 代細胞、無限增殖化細胞或經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞。所述細胞可以是動物中，例如非 人哺乳動物中的那些細胞。這些細胞，在進行本文指定的遺傳工程化之前， 可以獲得自多種商業(yè)來源和研究資源機構(gòu)，如，例如，美國典型培養(yǎng)物保藏 中心(American Type Culture Collection) (Rockville, MD)。目標分子包括蛋白 質(zhì)，例如任何本文所述的目標蛋白(見上文)。目標分子也包括多碎醇。 對細胞進行的遺傳工程化包括遺傳修飾如(i)缺失編碼具有N-糖基化活 性的蛋白質(zhì)的內(nèi)源基因；(ii)引入編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)(例如，內(nèi)源或外源蛋白)的突變形式的重組核酸(即，表達具有N-糖基化活性的突變蛋 白)；(iii)引入或表達RNA分子，所述RNA分子干擾具有N-糖基化活性的 蛋白質(zhì)的功能性表達；(iv)引入編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的野生型(例 如，內(nèi)源的或外源的)的重組核酸(即，表達具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì))； 或(v)改變編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的一種或多種內(nèi)源基因的啟動子 或增強子元件，由此改變它們編碼的蛋白質(zhì)的表達。RNA分子包括，例如， 小干擾RNA、短發(fā)夾RNA (shRNA)、反義RNA或微小RNA (miRNA)。應(yīng) 該理解的是，第(ii)項包括，例如，用相對于如下被替代的內(nèi)源基因編碼具有 更大N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因替代內(nèi)源基因(例如，通過同源重組)。遺 傳工程化還包括改變編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的內(nèi)源基因以產(chǎn)生具 有添加(例如，異源序列)、缺失或取代(例如，突變?nèi)琰c突變；保守或非保守 突變)的蛋白質(zhì)。突變可以特異性地引入(例如，定點誘變或同源重組；參加 隨附實施例)或者可以隨機引入(例如，可以對細胞進行化學誘變，如在例如 Newman和Ferro-Novick (1987) J. Cell Biol. 105(4):1587中所述，將其公開內(nèi) 容通過所述整體并入本文)。 本文描述的遺傳修飾可以導(dǎo)致如下的一種或多種(i)在經(jīng)遺傳修飾的細 胞中一種或多種N-糖基化活性的增加，(ii)在經(jīng)遺傳修飾的細胞中一種或多 種N-糖基化活性的減少，(iii)在經(jīng)遺傳修飾的細胞中一種或多種N-糖基化活 性的定位或胞內(nèi)分布的變化，或(iv)在經(jīng)遺傳^f務(wù)飾的細胞中一種或多種N-糖 基化活性的比例的變化。應(yīng)該理解的是，N-糖基化活性的量的增加可以歸因 于一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的過表達；內(nèi)源基因的拷貝數(shù)的 增加(例如，基因重復(fù))；或內(nèi)源基因的啟動子或增強子的改變，其刺激由所 述基因編碼的蛋白質(zhì)的表達增加。 一種或多種N-糖基化活性的減少可以歸 因于一種或多種蛋白質(zhì)的突變形式(例如，顯性陰性形式)的過表達，所述突 變形式具有改變N-糖基化的活性； 一種或多種干擾RNA分子的引入或表達， 所述干擾RNA分子降低一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的表達；或 一種或多種編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的內(nèi)源基因的缺失。 缺失或破壞一種或多種內(nèi)源基因的方法在隨附實施例中描述。例如，為 了通過同源重組破壞基因，'基因替代，，載體可以以一種使其包括可選擇的 標記基因的方式構(gòu)建。這些可選擇的標記基因可以在5'和3'端與長度足以介 導(dǎo)同源重組的基因部分可操作地連接。所述可選擇的標記可以是多種基因之一，所述基因或者補足宿主細胞的營養(yǎng)缺陷型(auxotrophy)，或者提供抗生素 抗性，包括URA3、 LEU2和HIS3基因。其它合適的可選擇標記包括CAT 基因，其賦予酵母細胞氯霉素抗性，或lacZ基因，其導(dǎo)致因表達p-半乳糖 脊酶產(chǎn)生的藍色菌落。然后使用本領(lǐng)域公知的方法(見下文)將基因替代載體 的線性化DNA片段引入細胞。線性片段向基因組中的整合和基因的破壞可 以基于所述選擇標記來測定，并且可以通過例如Southern印跡分析來聰、證。如在隨附實施例中詳述的，在可選'^的標記在選'^中使用之后，可以將 其從宿主細胞的基因組去除，通過例如Cre-loxP系統(tǒng)(見下文)。或者，基因替代載體可以以一種使其包括待破壞基因的部分的方式構(gòu)因編碼序列的失活片段。'失活片段'是這樣的基因片段，其編碼的蛋白質(zhì) 具有，例如，產(chǎn)自所述基因全長編碼序列的蛋白質(zhì)的活性的低于約10% (例 如，低于約9%,低于約8%,低于約7%，低于約6%，低于約5%,低于約 4%,低于約3%,低于約2%,低于約1%,或0%)。將這種基因部分以如下 方式插入載體，即沒有已知啟動子序列與該基因序列可操作連接，但是終止 密碼子和轉(zhuǎn)錄終止序列與所述基因序列的所述部分可操作地連接。然后可以同源重組的方式，于是將這種線性化的載體整合入所述基因的內(nèi)源對應(yīng)物 (counterpart)中。表達載體可以是自主性的或整合型的?？梢詫⒅亟M核酸(例如，編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的野生型或突 變形式的重組核酸)以表達載體的形式引入細胞，所述表達載體例如質(zhì)粒、 噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘?；虿《绢w粒。重組核酸可以保持在染色體外，或者它 可以被整合入酵母細胞染色體DNA。表達載體可以含有選擇標記基因，其 編碼細胞在選擇條件下生存所需的蛋白質(zhì)(例如，URA3，其編碼尿嘧啶生物 合成所需要的酶；或TRPl,其編碼色氨酸生物合成所需要的酶)，以允許檢 測和/或選擇那些用期望的核酸轉(zhuǎn)化的細胞(參見，例如，美國專利No. 4,704,362)。表達載體也可以包括自主復(fù)制序列(ARS)。例如，美國專利No. 4,837,148描述了自主復(fù)制序列，其為在巴斯德畢赤酵母中保持質(zhì)粒提供了適 合的方法。將美國專利No.4，837，148的^Hf內(nèi)容通過所述整體并入本文。整合型載體在例如美國專利No. 4,882,279 (將其公開內(nèi)容通過所述整體36并入本文)中披露。整合型載體通常包括連續(xù)排列的至少有第一可插入DNA片段、可選擇的標記基因和第二可插入DNA片段的序列。所述第一和第二 可插入DNA片段的長度各為約200個(例如，約250,約300，約350,約 400,約450，約500或約1000或更長)核香酸并且具有與待轉(zhuǎn)化物種基因組 DNA中的部分同源的核苷酸序列。將用于表達的含有感興趣的基因(例如， 編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因)的核苷酸序列插入這種載體的第一 和第二可插入DNA片段之間，在標記基因之前或是之后。可以在酵母轉(zhuǎn)化 之前將整合型載體線性化以促進感興趣的核苷酸序列整合入宿主細胞基因 組。表達載體可以包含(feature)在酵母(例如，解脂西洋蓍霉、」rxw/' ^/ew'm'vorara,或其它相關(guān)的雙態(tài)性酵母種)啟動子調(diào)控下的重組核酸，所述 啟動子使得它們能夠在酵母中表達。合適的酵母啟動子包括例如，ADC1、 TPIl、 ADH2、 hp4d、 POX和GallO (參見，例如，Guarente等(1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79(23):7410)啟動子。另外的合適啟動子在例如Zhu和Zhang (1999)Bioinformatics 15(7-8):608-611和美國專利No. 6,265,185中記載，將它 們每一篇的公開內(nèi)容通過所述整體并入本文。在將表達載體引入動物細胞 (例如哺乳動物細胞)的情況下，所述表達載體可以包含在適合用于在感興趣 的宿主細胞中表達的動物細胞啟動子調(diào)控下的重組核酸。哺乳動物啟動子的 實例包括，例如，SV40或巨細胞病毒(CMV)啟動子。啟動子可以是組成型或誘導(dǎo)型(條件性)的。組成型啟動子應(yīng)理解為這樣 的啟動子，其表達在標準培養(yǎng)條件下是恒定的。誘導(dǎo)型啟動子是響應(yīng)于一種 或多種誘導(dǎo)信號(inductioncue)的啟動子。例如，可以對誘導(dǎo)型啟動子進行化 學調(diào)節(jié)(例如，其轉(zhuǎn)錄活性受到化學誘導(dǎo)劑的存在或缺失調(diào)節(jié)的啟動子，所 述化學誘導(dǎo)劑例如醇、四環(huán)素、類固醇、金屬或其它小分子)或物理調(diào)節(jié)(例 如，其轉(zhuǎn)錄活性受到物理誘導(dǎo)物的存在或缺失調(diào)節(jié)的啟動子，所述物理誘導(dǎo) 物例如光或高溫或低溫)。誘導(dǎo)型啟動子也可以直接通過一種或多種轉(zhuǎn)錄因 子調(diào)節(jié)，所述轉(zhuǎn)錄因子本身直接受到化學或物理信號的調(diào)節(jié)。細胞的遺傳工程化還包括激活存在于宿主細胞中，但是通常在所述細胞 中不表達或在所述細胞中不以顯著水平表達的內(nèi)源基因(例如，編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因)。例如，可以修飾內(nèi)源基因的調(diào)節(jié)序列(例如， 基因啟動子或增強子)從而使可操作連接的編碼序列展現(xiàn)增加的表達。同源遺傳 工程化的細胞中所顯現(xiàn)的調(diào)節(jié)或誘導(dǎo)模式。用于引入基因的調(diào)節(jié)序列(例如， 啟動子或增強子)的改變的合適方法記載著，例如，美國專利申請公開No. 20030147868中，將其7>開內(nèi)容通過所述整體并入本文。應(yīng)理解的是，其它遺傳工程化的修飾也可以是條件性的。例如，可以將 基因條件性地缺失，使用例如位點特異性DNA重組酶如Cre-loxP系統(tǒng)(參見， 例如，Gossen等(2002) Ann. Rev. Genetics 36:153-173和美國申請No. 20060014264,將它們每一篇的公開內(nèi)容通過所述完整并入本文)?？梢允褂枚喾N方法將重組核酸引入本文所述的細胞，所述方法例如原生 質(zhì)球技術(shù)或全細胞氯化鋰酵母轉(zhuǎn)化方法。其它對于將質(zhì)粒或線性核酸載體轉(zhuǎn) 化入細胞有用的方法記載在，例如，美國專利No. 4,929,555; Hinnen等(1978) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75:1929; Ito等(1983) J. Bacteriol. 153:163;美國專 利No. 4,879,231;和Sreekrishna等(1987) Gene 59:115中，將它們每一篇的 公開內(nèi)容通過所述完整并入本文。電穿孔和PEG1000全細胞轉(zhuǎn)化方法也可 以使用，如Cregg和Russel， Methods in Molecular Biology: Pichia Protocols, Chapter 3， Humana Press, Totowa, N丄，第27-39頁(1998)中所述，將其公開內(nèi) 容通過所述完整并入本文。動物細胞的轉(zhuǎn)染可以包括，例如，使用磷酸鈣、 電穿孔、熱激、脂質(zhì)體或轉(zhuǎn)染試劑如FUGENE⑧或LIPOFECTAMINE⑧或通 過使棵核酸載體與細胞在溶液中接觸(參見，例如，Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Edition vol. 1, 2 and 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York, USA, Nov. 1989;將其 公開內(nèi)容通過所述完整并入本文)將載體引入細胞?？梢酝ㄟ^使用合適的技術(shù)來選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的酵母細胞，所述技術(shù)包括但不 限于，在轉(zhuǎn)化之后在缺乏所需生化產(chǎn)物(由于細胞的營養(yǎng)缺陷型)條件下培養(yǎng) 營養(yǎng)缺陷型細胞，選擇和檢測新的表型，或在對于缺乏轉(zhuǎn)化體中所含抗性基 因的酵母為毒性的抗生素存在下進行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化體也可以通過將表達盒整合 入基因組來選擇和/或驗證，其可以通過例如Southern印跡或PCR分析來評 定。在將載體卩1入感興趣的靶麵胞之前，可以將載體在細菌細胞如大腸桿菌(￡. co/Z)中培養(yǎng)(例如，擴增)。載體DNA可以通過任何本領(lǐng)域已知的方法從 細菌細胞分離，所述方法致使載體DNA從細菌環(huán)境中純化。經(jīng)純化的載體 DNA可以用酚、氯仿和醚粗提(extract extensively),以確保沒有大腸桿菌蛋 白存在于質(zhì)粒DNA制備物中，因為這些蛋白質(zhì)對于哺乳動物細胞是毒性的。 如本文所述，遺傳工程化可以用于表達(例如，過表達)多種基因、向多 種基因中引入修飾或缺失多種基因，例如，編碼具有N-糖基化活性的蛋白 質(zhì)的基因。這些基因包括，例如，ALG7、 ALG13、 ALG14、 ALG1、 ALG2、 ALGll、 RFT1、 ALG3、 ALG9、 ALG12、 ALG6、 ALG8、 ANL1、 ALGIO、 ALG5、 OST3、 OST4、 OST6、 STT3、 OSTl、 OST5、職P1、 SWP1、 OST2、 DPM1、 SEC59、 OCHl、 MNN9、 VAN1、 M麗8、 MNNIO、 MNNll、 HOCl、 MNN2、 M麗5、 MNN6、 KTR1、 YUR1、 MNN4、 KRE2、 KTR2、 KTR3、 MNN1、 MNS1、 MNN4、 PNOl、 MNN9、葡糖苷酶I、葡糖苷酶II、或內(nèi)切 甘露糖苷酶(endomannosidase)。編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因可以 來自任何含有這樣的基因的物種(例如，低等真核生物(例如，真菌(包括酵母) 或錐蟲)，植物，或動物(例如，昆蟲、鳥、爬行動物或哺乳動物(例如，嚙齒 動物如小鼠或大鼠、犬、貓、馬、山羊、牛、豬、非人靈長類動物或人))。 編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因可以從中獲得的示例性真菌菌種包 括，但不限于，異常畢赤酵母(尸/c/n'fla'oma/a)、牛腸畢赤酵母CP/c/z/a幻v&)、 力口拿大畢赤酵母(尸/c/z/a ozwo^e'w.'、 /Vc/ ,a c 所述甘露糖苦酶可以是MNS1 。 例如，所述經(jīng)遺傳工程化的細胞可以過表達甘露糖香酶(例如，a-l，2-甘 露糖香酶或任何其它本文所述的甘露糖苷酶)，但是不缺乏OCH1基因或其 基因產(chǎn)物(例如，mRNA或蛋白質(zhì))。所述甘露糖香酶可以是所述蛋白質(zhì)的野 生型形式，或者可以是突變形式，例如含有甘露糖苷酶和HDELER-保留氨 基酸序列的融合蛋白(參見實施例)。(應(yīng)該理解可以將任何具有N-糖基化活 性的蛋白質(zhì)工程化改造成包含HDEL序列的融合蛋白)。 在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細胞可以含有能夠促進目標分 子的改變的N-糖基化形式進行甘露糖基磷酸化的活性。例如，可以將編碼 促進N-聚糖進行磷酸化的活性的核酸(例如MNN4， MNN6， PN01)引入遺傳 工程化的細胞，所述細胞能夠增加目標分子的N-糖基化的磷酸化。 在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細胞可以含有能夠去除甘露糖 殘基的活性(例如，甘露糖苷酶，如來自Jack Bean的甘露糖苷酶)，所述甘露 糖殘基遮蔽N-糖基化改變的分子的磷酸化。 在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細胞能夠從Man5GlcNAc2去除 葡萄糖殘基。例如，所述經(jīng)遺傳修飾的細胞可以過表達具有a-l，3-葡糖苷酶 活性的蛋白質(zhì)，例如，但不限于，變聚糖酶或葡糖香酶II (例如解脂西洋蓍 霉、布氏錐蟲或本文所述的任何其它真菌菌種的葡糖苷酶II)的a和/或f3亞 基。 在具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)源自與表達該蛋白質(zhì)的細胞不同類型(例 如，不同種)的細胞的實施方案中，可以為了在特定的感興趣的細胞中表達 而對編碼所述蛋白質(zhì)的核酸進行密碼子優(yōu)化。例如，可以對來自布氏錐蟲的 編碼具有N-糖基化的蛋白質(zhì)的核酸進行密碼子優(yōu)化用于在酵母細胞(例如解 脂西洋蓍霉)中表達。這種密碼子優(yōu)化可以用于增加蛋白質(zhì)在感興趣的細胞 中的表達。用于對編碼蛋白質(zhì)的核酸進行密碼子優(yōu)化的方法是本領(lǐng)域已知 ,至少7.0以下，至少6.9以下，至少6.8 ，至少6.5以下，至少6.4以下，至少6.3 ,至少6.0以下，至少5.9以下，至少5.8 ,至少5.5以下，至少5.4以下，至少5.3 ，至少5.0以下，至少4.9以下，至少4.8的，并且記載在例如Gao等(Biotechnol. Prog. (2004) 20(2): 443 -448)， Kotula 等(Nat. Biotechn, (1991) 9， 1386 — 1389)和Bennetzen等(J. Biol. Chem. (1982) 257(6):2036-3031)中。 也可以對細胞進行遺傳工程化以主要產(chǎn)生作為哺乳動物(例如，人)糖基 化途徑的中間體的N-聚糖。例如，可以將編碼具有N-糖基化活性的人的蛋 白的一種或多種核酸引入細胞。在一些實施方案中，可以將人的蛋白引入細 胞，并且可以抑制(例如，缺失或突變)一種或多種具有N-糖基化活性的內(nèi)源 酵母蛋白。用于'人源化，，真菌糖基化途徑的技術(shù)記載在，例如，Choi等(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(9):5022-5027; Verveken等(2004) Appl. Environ. Microb. 70(5 ):263 9-2646 ; 和 Gerngross (2004) Nature Biotech. 22(11): 1410-1414中，將它們每一篇的公開內(nèi)容通過所述整體并入本文。 在遺傳工程化涉及例如改變蛋白質(zhì)的表達或外源蛋白(包括內(nèi)源蛋白的 突變形式)的表達的情況下，可以使用多種技術(shù)來測定經(jīng)遺傳工程化的細胞 是否表達該蛋白質(zhì)。例如，編碼所述蛋白質(zhì)的mRNA或蛋白質(zhì)本身的存在 可以如下檢測，分別使用例如Northern印跡或RT-PCR分析或Western印跡 分析。具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的胞內(nèi)定位可以通過使用多種技術(shù)來分 析，所述技術(shù)包括亞細胞分級和免疫熒光。 另外的遺傳修飾和將它們引入本文描述的任何細胞的方法可以根據(jù)例 如，美國專利Nos. 7,029,872; 5,272,070;和6,803,225;和美國專利申請公 開Nos. 20050265988、 20050064539、 20050170452和20040018588的/>開內(nèi) 容修改適用，將它們每一篇的公開內(nèi)容通過所述整體并入本文。 盡管在雙態(tài)性酵母菌種中為了實現(xiàn)體內(nèi)產(chǎn)生Man5GlcNAc2和 Man3GlcNAc2而進行的工程化步驟可能與在其它酵母菌種中進行的工程化 步驟不同，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚在雙態(tài)性酵母中體內(nèi)產(chǎn)生經(jīng)修飾的糖 蛋白(具有MansGlcNAc2和Man3GlcNAc2核心N-聚糖結(jié)構(gòu))的工程化技術(shù)可 以根據(jù)常規(guī)實驗法從包括但不限于美國專利No. 7,326,681和美國公開Nos. 200400185卯、20060040353和20060286637 (將它們每一篇的公開內(nèi)容通過 所述整體并入本文)中公開方法修改獲得。由此可以將經(jīng)修改的方法用于實 現(xiàn)糖蛋白的產(chǎn)生，所述糖蛋白經(jīng)修飾而具有人類型雜合和復(fù)合的N-聚糖。 這些復(fù)合N-聚糖可以在上文指定的核心聚糖上具有2-5個以GlcNAc殘基起 始的分支，其可以進一步延伸，例如，用半乳糖、果糖、唾液酸殘基延伸。在一些實施方案中，具有N-糖基化活性的突變蛋白或野生型蛋白可以 從經(jīng)遺傳工程化的細胞中使用標準技術(shù)分離。例如，在所述經(jīng)遺傳工程化的 細胞中表達突變蛋白或野生型蛋白之后，可以從該細胞本身或從培養(yǎng)該細胞 的培養(yǎng)基分離所述蛋白質(zhì)。分離蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的并且包括，例 如，液相層析(例如，HPLC)、親和層析(例如，金屬螯合或免疫親和層析)、 離子交換層析、疏水相互作用層析、沉淀或差示溶解(differential solubilization)。 在一些實施方案中，可以將具有N-糖基化活性的分離的蛋白質(zhì)冷凍、 凍干或固定，并且儲存在合適條件下，所述條件允許該蛋白質(zhì)保持活性。 本公開還提供本文描述的任何經(jīng)遺傳工程化的細胞的基本上純的培養(yǎng) 物。如用于本文，經(jīng)遺傳工程化的細胞的'基本上純的培養(yǎng)物'是這樣的細 胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物中活細胞總數(shù)的低于約40%(即，低于約35%; 30%; 25%; 20%; 15%; 10%; 5%; 2%; 1%; 0.5%; 0.25%; 0.1%; 0,01%; 0.001%; 0.0001%;或甚至更低)是除所述經(jīng)遺傳工程化的細胞之外的活細胞， 例如，細菌、真菌(包括酵母)、支原體或原生動物細胞。術(shù)語'約'在本文 上下文中指相關(guān)的百分比可以比指定百分比高或低所述指定百分比的15%。 因此，例如，約20%可以是170/。-23%。這樣的經(jīng)遺傳工程化的細胞的培養(yǎng) 物包括細胞和培養(yǎng)、儲存或轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可以是液體、半固體(例如， 膠狀培養(yǎng)基)或是冷凍的。培養(yǎng)物包括培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中或培養(yǎng)在半固體 培養(yǎng)基中/上的細胞、或儲存或轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基(包括冷凍儲存或轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基)中儲 存或轉(zhuǎn)運的細胞。培養(yǎng)物可以在培養(yǎng)容器或儲存容器或基底(例如，培養(yǎng)皿、 燒瓶或管或儲存小瓶或管)中。 本文描述的經(jīng)遺傳工程化的細胞可以如下儲存，例如，作為冷凍細胞懸 液，例如，在含有冷凍保護劑如甘油或蔗糖的緩沖劑中，作為凍干的細胞。 或者，它們可以例如作為干燥的細胞制備物儲存，通過例如流化床干燥或噴 霧干燥，或任何其它合適的干燥方法。 產(chǎn)生N-糖基化改變的分子的方法 本文描述產(chǎn)生目標分子的改變的N-糖基化形式的方法。所述方法通常 涉及使目標分子與來自經(jīng)遺傳工程化的細胞(例如，真菌細胞(例如，解脂西 洋蓍霉、/1rx'/a a&m'mVwwM或本文所述的任何其它 關(guān)的雙態(tài)性酵母細胞)、植物細胞或動物細胞(例如，線蟲、昆蟲、植物、鳥、爬行動物或哺乳 動物(例如，小鼠、大鼠、兔、倉鼠、沙鼠、犬、貓、山羊、豬、牛、馬、 鯨、猴或人))的一種或多種N-糖基化活性接觸。所述方法可以是基于細胞的 或不基于細胞的。 基于細胞的方法可以包括向經(jīng)遺傳工程化而具有至少一種經(jīng)修飾N-糖 基化活性的細胞(例如，真菌細胞(例如，解脂西洋蓍霉、爿no/A3 aAw'w'vorara N-糖基化的目標分子的核酸，其中所述細胞以改變的N-糖基化形式產(chǎn)生所 述目標分子。所述目標分子可以是，例如，蛋白質(zhì)如任何本文所述的目標蛋 白。在目標蛋白是脂質(zhì)的實施方案中，核酸可以是編碼一種或多種促進脂質(zhì) 合成的酶的核酸。 通過對細胞進行遺傳工程化來產(chǎn)生的修飾的類型在本文描述(參見隨附 實施例和上文的'遺傳工程化的細胞')。 用于引入核酸的方法是本領(lǐng)域已知的并且記載在隨附實施例和上文中。 在遺傳工程化的細胞中引入或表達目標分子(例如，目標蛋白)可以導(dǎo)致 運輸目標分子通過細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和/或高爾基體，由此產(chǎn)生目標分子的改變的 N-糖基化形式。 在對目標分子進行加工之后(例如，在經(jīng)遺傳修飾的細胞中)，目標分子 (例如，目標蛋白)的改變的N-糖基化形式可以含有一種或多種N-聚糖結(jié)構(gòu)。 例如，目標分子的改變形式可以含有一種或多種特定的N-具體結(jié)構(gòu)如 Man5GlcNAc2 (結(jié)構(gòu)式I或VII;圖4), Man8GlcNAc2 (結(jié)構(gòu)式I;圖4)， Man9GlcNAc2 (結(jié)構(gòu)式II;圖4)， Man3GlcNAc2 (結(jié)構(gòu)式XIV;圖4)， Glc!Mari5GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式VIII;圖4),或Glc2Man5GlcNAc2 (結(jié)構(gòu)式IX;圖 4) ('Man，，是甘露糖；'Glc，，是葡萄糖；而'GlcNAc，，是N-乙酰葡糖胺)。 產(chǎn)生自經(jīng)遺傳工程化的細胞的N-糖基化改變的目標分子可以是均質(zhì)的 (即，全部N-糖基化改變的分子含有相同的特定N-聚糖結(jié)構(gòu))或者可以是基本 上均質(zhì)的。'基本上均質(zhì)'是指改變的目標分子是由經(jīng)遺傳工程化的細胞產(chǎn) 生的改變N-糖基化的目標分子的至少約25% (例如，至少約27%,至少約 30%，至少約35%，至少約40%，至少約45%，至少約50%，至少約55%， 至少約60%，至少約65%,至少約70%，至少約75%,至少約80%,至少 約85%，至少約90%或至少約95%或至少約99%)。在經(jīng)遺傳工程化的細胞包括一種或多種影響N-聚糖磷酸化的N-糖基化 活性的情況下，目標分子的改變的N-糖基化形式可以具有至少約25% (例如， 至少約27%，至少約30%,至少約35%，至少約40%，至少約45%,至少 約50%，至少約55%，至少約60。/0，至少約65%，至少約70%，至少約75% 或至少約80%)的它的甘露糖基殘基是磷酸化的。 在遺傳工程化的細胞的任何遺傳修飾在誘導(dǎo)信號(例如，化學或物理信 號)存在下為誘導(dǎo)型或條件性的情況下，可以任選地將所述遺傳工程化的細 胞在引入核酸之前、過程中或之后在誘導(dǎo)劑存在下培養(yǎng)。例如，在引入編碼 目標蛋白的核酸之后，可以將所述細胞曝露于化學誘導(dǎo)劑，所述化學誘導(dǎo)劑 能夠促進一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的表達。在多種誘導(dǎo)信號 誘導(dǎo)一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)條件性表達的情況下，可以使 細胞與多種誘導(dǎo)信號接觸。 在通過一種或多種N-糖基化活性加工之后，將改變的目標分子分離。 改變的目標分子可以經(jīng)由編碼序列(外源核酸所固有的或工程化至表達載體 中的)提供的機制分泌至培養(yǎng)基中，所述編碼序列指導(dǎo)所述分子從細胞分泌。 細胞裂解物或培養(yǎng)基中改變的目標分子的存在可以通過多種用于檢測分子 存在的標準規(guī)程來驗證。例如，在改變的目標分子是蛋白質(zhì)的情況下，這樣 的規(guī)程可以包括，但不限于，使用對于所述改變的目標蛋白(或目標蛋白本 身)特異性的抗體進行的免疫印跡或放射免疫沉淀，對于所述改變的目標蛋 白(或目標蛋白本身)特異性的配體進行的結(jié)合，或測試改變的目標蛋白(或目 標蛋白本身)的特異性酶活性。 在一些實施方案中，可以將分離的改變的目標分子冷凍、凍干或固定， 并且儲存在合適條件下，例如，所述條件允許改變的目標分子保持生物學活 性。 可以對目標分子的改變的N-糖基化形式進一步進行體內(nèi)加工(例如，在 經(jīng)遺傳工程化的細胞中)，或者可以在從經(jīng)遺傳工程化的細胞或細胞培養(yǎng)基 分離之后進行體外加工。進一步加工可以包括對改變的目標分子的一種或多 種N-聚糖殘基的修飾或?qū)Ω淖兊哪繕朔肿拥腘-聚糖殘基之外的修飾。改變 的目標分子的額外的加工可以包括添力o(共價或非共價結(jié)合)異源模塊如聚合 物或載體。進一步的加工也可以包括對改變的目標分子進行的酶或化學處理。酶處理可以包括使改變的目標分子與一種或多種糖苦酶(例如，甘露糖 香酶或甘露聚糖酶)、磷酸二酯酶、磷脂酶、糖基轉(zhuǎn)移酶或蛋白酶接觸足以 誘導(dǎo)對所述改變的目標分子的修飾的時間。酶處理也可以包括使所述改變的 目標分子與能夠從Mari5GlcNAc2去除一種或多種葡萄糖殘基的酶接觸，所述 酶例如，但不限于，甘露糖苷酶或葡糖苷酶II的a和/或(3亞基?；瘜W處理 可以例如包括使改變的目標分子與酸(例如氫氟酸)接觸足以誘導(dǎo)對所述改變 的目標分子的修飾的時間。特定條件下的氫氟酸處理特異性地去除與聚^f唐以 磷酸二酯鍵連接的甘露糖殘基，同時在聚糖上保留磷酸。改變的目標分子可 以通過從一個或多個N-聚糖添加或去除磷酸基團來進一步加工。例如，可 以使改變的目標分子與甘露糖基激酶或甘露糖基磷酸酶接觸。 在一些實施方案中，任何文描述的改變的目標分子可以在分離之后與異 源模塊附接，例如，使用酶或化學方法。'異源模塊'是指與改變的目標分子 結(jié)合(例如，共價或非共價)的任何成分，所述成分不同于原始存在于所述改 變的目標分子之上的成分。異源模塊包括，例如，聚合物、載體、佐劑、免 疫毒素或可檢測(例如，熒光、發(fā)光或放射性)的模塊在一些實施方案中，可 以向改變的目標分子添加額外的N-聚糖。 應(yīng)該理解的是，可以，但不需要在遺傳工程化的細胞中加工目標分子。 例如，本公開還包括無細胞的產(chǎn)生具有改變的N-糖基化形式的目標分子的 方法，所述方法包括使目標分子在N-糖基化條件下與制備自細胞(例如，真 菌細胞(例如，解月旨西洋蓍霉、^n;w/a afifem'm'vorara或本文描述的任何其它相 關(guān)的雙態(tài)性酵母細胞)、植物細胞或動物細胞(例如，線蟲、昆蟲、植物、鳥、 爬行動物、或哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、兔、倉鼠、沙鼠、犬、貓、山 羊、豬、牛、馬、鯨、猴或人))的細胞裂解物接觸的步驟，所述細胞經(jīng)遺傳 工程化而具有至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性，其中使目標分子與所述細 胞裂解物接觸產(chǎn)生目標分子的改變的N-糖基化形式。 'N-糖基化條件'是指將混合物(例如，目標分子和細胞裂解物的混合 物)在允許改變的N-糖基化的條件下溫育(如上所述)。 用于獲得細胞裂解物(在所述裂解物中保留一種或多種N-糖基化活性的 活性或完整性)的合適方法可以包括使用合適的緩沖液和/或抑制劑，包括核 酸酶、蛋白酶和磷酸酶抑制劑，其保護或最小化細胞裂解物中N-糖基化活 性的改變。這些抑制劑包括，例如，螯合劑如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇雙(P-氨基乙醚)N，N,N 1 ，Nl-四乙酸(EGTA),蛋白酶抑制劑如苯曱基磺酰氟化 物(PMSF)、抑肽酶、亮抑肽酶、抗痛素等，和磷酸酶抑制劑如磷酸鹽、氟化 鈉、釩酸鹽等。抑制劑可以這樣選擇，即它們不干擾或僅最小程度負面影響 N-糖基化活性或感興趣的活性。用于獲得含有酶活性的裂解物的合適的緩沖 齊寸禾口條4牛i己載在，例^口, Ausubel等Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47)， John Wiley & Sons, New York (1999); Harlow和Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988》 Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1999); Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd ed. Burtis and Ashwood， eds. W.B. Saunders， Philadelphia, (1999)中。 可以將細胞裂解物進一 步加工以使當?shù)叵蜃頳 、化干擾物質(zhì)的存在。 如有需要，可以通過多種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法將細胞裂解物分級，所 述方法包括亞細胞分級和層析技術(shù)，如離子交換、疏水和反向、大小排阻、 親牙口、發(fā)u7JC電荷i秀導(dǎo)層沖斤等(參見，例i口， Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, third edition, Springer-Verlag, New York (1993); Burton和Harding, J. Chromatogr. A 814:71-81 (1998))。 在一些實施方案中，可以制備細胞裂解物，其中全部細胞器保持完整和 /或有功能。例如，裂解物可以含有完整的糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、完整的光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或 完整的高爾基體中的一種或多種。用于制備含有完整的細胞器的裂解物和測 試細胞器的功能性的合適方法記載在，例如，Moreau等(1991) J.Biol. Chem. 266(7):4329-4333; Moreau等(1991) J. Biol. Chem. 266(7):4322-4328; Rexach 等(1991) J. Cell Biol. U4(2):219-229;和Paulik等(1999) Arch. Biochem. Biophys. 367(2):265_273中；將它們每一篇的公開內(nèi)容通過所述整體并入本 文。 本公開還提供產(chǎn)生具有改變的N-糖基化形式的目標分子的方法，其包 括使目標分子在N-糖基化條件下與一種或多種具有N-糖基化活性的分離的 蛋白質(zhì)接觸的步驟，其中使所述目標分子與一種或多種具有N-糖基化活性 的蛋白質(zhì)接觸產(chǎn)生目標分子的改變的N-糖基化形式，并且其中所述一種或 多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)制備自經(jīng)遺傳工程化而具有至少 一種經(jīng)修 飾的N-糖基化活性的細胞(例如真菌細胞(例如，解脂西洋蓍霉、^'xw/a atfew/m'wrara或本文描述的任何其它相關(guān)的雙態(tài)性酵母細胞)、植物細力包或 49動物細胞(例如，線蟲、昆蟲、植物、鳥、爬行動物、或哺乳動物(例如，小 鼠、大鼠、兔、倉鼠、沙鼠、犬、貓、山羊、豬、牛、馬、鯨、猴或人))。 可以使用如上所述的標準技術(shù)將一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白 質(zhì)純化?？梢允鼓繕朔肿优c一種或多種蛋白質(zhì)在合適的緩沖液中接觸足以誘 導(dǎo)對目標分子的修飾的時間，如例如，Lee和Park (2002) 30(6):716-720以及 Fujita和Takegawa (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 282(3):678-682中 所述，將所述公開內(nèi)容通過所述完整并入本文。 在一些實施方案中，可以使目標分子僅與一種具有N-糖基化活性的蛋 白質(zhì)接觸。在一些實施方案中，可以使目標分子與超過一種具有N-糖基化 活性的蛋白質(zhì)接觸?？梢允鼓繕朔肿优c超過一種蛋白質(zhì)同時或相繼接觸。在 將目標分子與超過一種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)相繼接觸的情況下，可 以，但不需要，將目標分子在一個或多個步驟之后純化。即，可以使目標分 子與蛋白活性A接觸，然后在將所述分子與蛋白活性B接觸之前進行純化， 等等。 在無細胞方法的一些實施方案中，在使目標分子與一種或多種N-糖基 化活性接觸之前將目標分子與固相支撐物連接可能是有利的。這樣的連接能 夠使N-糖基化修飾之后的純化更簡單。合適的固相支撐物包括，但不限于， 多孔測定平板、顆粒(例如，^磁性或編碼顆粒)、柱或膜。 用于檢測目標分子的N-糖基化(例如，改變的N-糖基化)的方法包括 DNA測序儀輔助型(DSA)、熒光團輔助型糖電泳(FACE)(如隨附實施例中所 述)或表面增強型激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOFMS)。例如，分析 可以利用DSA-FACE，其中，例如，將糖蛋白變性，其后固定在例如膜上。 然后可以將糖蛋白用合適的還原劑如二硫蘇糖醇(DTT)或p-巰基乙醇還原。 蛋白質(zhì)的巰氬基可以使用酸如碘乙酸來羧化。然后，可以使用酶如N-糖苷 酶F將N-聚糖從蛋白質(zhì)釋放。任選地，N-聚糖可以通過還原性氨基化重建 和衍生化。然后可以將衍生化的N-聚糖濃縮。適合用于N-聚糖分析的儀器 包括，例如，ABI PRISM 377 DNA測序儀(Applied Biosystems)。數(shù)據(jù)分析 可以使用例如GENESCAN 3.1軟件(Applied Biosystems)進4亍。任選地，可 以將分離的甘露糖蛋白進一步用一種或多種酶處理以確認它們的N-聚糖狀 態(tài)。示例性的酶包括，例如，a-甘露糖普酶或a-l，2甘露糖苷酶，如隨附實 施例中所述。另外的N-聚糖分析方法包括，例如，質(zhì)譜(例如，MALDI-TOF-MS)，正相、反相高壓液相層析(HPLC)和離子交換層析(例如， 當未標記聚糖時使用脈沖電流計檢測，而如果對聚糖進行了合適的標記則使 用UV吸光度或萸光)。還參見Callewaert等(2001)Glycobiology 11(4):275-281 和Freire等(2006) Bioconjug. Chem. 17(2):559-564,將它們每一篇的公開內(nèi)容 通過所述整體并入本文。 可由N-糖基化改變的分子處理的病癥 本文描述的分離的、N-糖基化改變的分子(例如，N-糖基化改變的蛋白 質(zhì)或多萜醇)可以用于治療多種疾病，所述疾病可以通過施用一種或多種N-糖基化改變的分子來治療(例如，N-糖基化改變的蛋白質(zhì))。能夠通過施用N-糖基化改變的分子(例如，改變的N-糖蛋白或改變的N-糖基化的多萜醇)治療 或預(yù)防的一些特定醫(yī)學狀況的實例在下節(jié)中評述。 (i)代謝紊亂 代謝紊亂是影響個體人(或動物)細胞內(nèi)能力產(chǎn)生的病癥。大多數(shù)代^f紊 亂是遺傳性的，盡管一些可以因飲食、毒素、感染等而'獲得'。遺傳性代 謝紊亂也稱作代謝的先天性缺陷。概括而言，遺傳性代謝紊亂是由遺傳缺陷 引起的，所述缺陷導(dǎo)致缺失或不正確地構(gòu)建細胞代謝過程中的一些步驟所必 須的酶。最大幾類的代謝紊亂是糖代謝的紊亂、氨基酸代謝的紊亂、有機酸 代謝的紊亂(有機酸尿癥(organic acidurias)),脂肪酸氧化和線粒體代謝的紊 亂，卟啉代謝的紊亂，嘌呤或嘧啶代謝的紊亂，類固醇代謝的紊亂，線粒體 功能的紊亂，過氧化物酶體功能的紊亂和溶酶體貯積病(LSD)。 能夠通過使用一種或多種本文描述的N-糖基化改變的分子(或其藥物組 合物)來治療的代謝紊亂的實例包括，例如，遺傳性血色病(hereditary hemochromatosis)、目艮皮月夫白4匕病(oculocutaneous albinism)、蛋白C (protein C deficiency)、 I型遺傳性血管性水胂(type I hereditary angioedema)、先天性蔗 糖酶-異麥芽糖酶在失乏(congenital sucrase-isomaltase deficiency)、克-纟內(nèi)二氏II 型(Crigler-Najjar type 11)、 Laron綜合征(Laron syndrome)、遺傳性髓過氧化物 酶(hereditary Myeloperoxidase)、 原發(fā)性甲狀A(yù)泉才幾能減退(primary hypothyroidism)、先天性長QT綜合征(congenital long QT syndrome)、酪氨酸 結(jié)合3求蛋白缺乏(tyroxine binding globulin deficiency)、家族性高膽固醇血癥(familial hypercholesterolemia)、 家族性乳糜微粒血癥(familial chylomicronemia)、 a卩-月旨蛋白血癥(a(3-lipoproteinema)、葉氐原生質(zhì)月旨蛋白A 平(low plasma lipoprotein A levels)、伴有肝損傷的遺傳性氣月中(hereditary emphysema with liver injury)、 先天性曱狀^>才幾能減退(congenital hypothyroidism)、成骨不全(osteogenesis imperfecta)、 遺傳性血纖維蛋白原過 少(hereditary hypofibrinogenemia) 、 a-1 #元月夷)疑乳蛋白酶擊失乏 (a-1 antichymotrypsin deficiency)、 腎原性尿崩癥(nephrogenic diabetes insipidus)、 垂體^申纟至^卩尿崩癥(neurohypophyseal diabetes insipidus)、 il^香脫 氨酶缺乏(adenosine deaminase deficiency)、佩-邁二氏病(Pelizaeus Merzbacher disease)、 IIA型馮維勒布蘭德病(von Willebrand disease type IIA)、結(jié)合性因 子V和VIII缺乏(combined factors V and VIII deficiency)、遲發(fā)性脊推骨媒發(fā) 育不全(spondylo-epiphyseal dysplasia tarda)、無月7:M各月莫(ch0r0ideremia)、 I纟田月包 病(I cell disease),白頓氏病(Batten disease)、共濟失調(diào)性毛細血管擴張癥 (ataxia telangiectasias)、 常染色體顯性多嚢性腎病(ADPKD-autosomal dominant polycystic kidney disease)、 微絨毛包含病(microvillus inclusion disease)、纟*核性石更化(tuberous sclerosis) 、 Lowe目艮腦腎綜合4正 (oculocerebro-renal syndrome of Lowe)、月幾蓁纟宿'l'生柳J索石更4b(amyotrophic lateral sclerosis)、骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome)、棵淋巴細胞綜合 征(Bare lymphocyte syndrome)、 丹吉爾病(Tangier disease)、 家力矣性肝內(nèi)月旦汁 郁積(familial intrahepatic cholestasis), X連鎖的腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥(X-linked adreno-leukodystrophy)、 Scott綜合征(Scott syndrome)、 1型和2型海-普二氏 綜合征(Hermansky-Pudlak syndrome types 1 and 2)、左爾威格氏綜合征 (Zellweger syndrome)、月支才艮點^大庫欠骨發(fā)育異常(rhizomelic chondrodysplasia puncta)、常染色體隱性原發(fā)性高草酸尿(autosomal recessive primary hyperoxaluria)、 Mohr Tranebjaer綜合征(Mohr Tranebjaerg syndrome)、脊骨逸延 髓月幾萎縮(spinal and bullar muscular atrophy)、原發(fā)性睫運動障礙(primary ciliary diskenesia)(卡》荅才各內(nèi)氏綜合4正(Kartagener，s syndrome))、巨人癥詳口月支端 月巴大癥(giantism and acromegaly)、享L溢(galactorrhea)、 艾迪遜氏病(Addison's disease)、腎上腺性男性化(adrenal virilism)、庫興氏綜合征(Cushing，s syndrome)、酮酸中毒(ketoacidosis)、原發(fā)性或繼發(fā)性醛固酮增多癥(primary or secondary aldosteronism)、 米-迪綜合征(Miller Dieker syndrome)、 無腦回(lissencephaly)、運動3申經(jīng)元病(motor neuron disease)、阿史爾氏綜合4正(Usher，s syndrome)、威-阿二氏綜合征(Wiskott-Aldrich syndrome)、奧4風齊氏綜合4正 (Optiz syndrome)、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、遺傳性月夷腺炎(hereditary pancreatitis)、抗石舞脂綜合4正(anti-phospholipid syndrome)、重疊結(jié)締組織病 (overlap connective tissue disease), 斯耶格倫氏綜合征(Sj6gren，s syndrome)、 僵體綜合征(stiff-man syndrome)、 Brugada綜合征(Brugada syndrome)、 芬蘭 型先天性腎病綜合征(congenital nephritic syndrome of the Finnish type)、 ；fi-約 二氏綜合征(Dubin-Johnson syndrome) 、 X連鎖4氐石奔酸鹽血癥(X-linked hypophosphosphatemia)、佩德里得綜合征(Pendred syndrome)、嬰兒期持續(xù)性 高血胰島素低血糖(persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy)、遺傳 性J求形紅細胞增多癥(hereditary spherocytosis)、 無血漿酮藍蛋白血癥 (acemloplasminemia)、嬰JL^申纟至元蠟才羊月旨4曷質(zhì);^禾口、癥(infantile neuronal ceroid lipofuscinosis)、假性軟骨發(fā)育不全和多發(fā)性骨骺發(fā)育不良(不 全)(pseudoachondroplasia and multiple epiphyseal)、 Stargardt樣黃斑發(fā)育不良 (Stargardt-like macular dystrophy) 、 X連鎖夏-馬-圖三氏病(X-linked Charcot-Marie-Tooth disease)、常染色體顯性視網(wǎng)膜色素變性(autosomal dominant retinitis pigmentosa) 、 Wolcott-Rallison 綜合征(Wolcott-Rallison syndrome)、 庫興氏病(Cushing，s disease)、 月支帶月幾營養(yǎng)不良(limb-girdle muscular dystrophy)、 IV型粘多糖貝i積病(mucoploy-saccharidosis type IV)、芬 蘭遺傳性家力矣性淀并分才羊變性(hereditary familial amyloidosis of Finish)、安德才l 氏病(Anderson disease)、肉瘤(sarcoma)、十曼性髓單核細胞性白血病(chronic myelomonocytic leukemia)、 心肌病(cardiomyopathy)、 面生殖發(fā)育異常 (faciogenital dysplasia)、 Torsion病(Torsion disease)、 亨廷牽頁禾口脊骨逸小月鹵姿纟宿 (Huntington and spinocerebellar ataxias) 、 hereditary hyperhomosyteinemia、 多 神經(jīng)病(polyneuropathy), 下運動神經(jīng)元病(lower motor neuron disease)、 色素 性視網(wǎng)膜炎(pigmented retinitis)、 血清陰性多關(guān)節(jié)炎(seronegative polyarthritis), 間質(zhì)月申纖維化(interstitial pulmonary fibrosis)、 雷諾氏現(xiàn)象 (Raynaud's phenomenon)、韋才各纟內(nèi)氏肉芽月中病(Wegner，s granulomatosis),蛋白 尿(preoteinuria)、 CDG-Ia、 CDG-Ib、 CDG-Ic、 CDG-Id、 CDG-Ie、 CDG畫If、 CDG-IIa、 CDG陽IIb、 CDG-IIc、 CDG-IId、埃-當二氏綜合征(Ehlers-Danlos syndrome)、多發(fā)性外生骨疣(multiple exostoses)、格里斯塞利氏綜合征 53(Griscelli syndrome) (1型或2型)或X連鎖性非特異性腦力發(fā)育遲緩(X-linked non-specific mental retardation)。此夕卜，4戈i射紊亂還可包4舌溶酶體貯積病例^口， 但不限于，法布里氏病、法勃氏病(Farber disease)、高歇爾氏病、GMi神經(jīng) 節(jié)糖苷沉積癥(GM廣gangliosidosis)、泰-沙二氏病、桑德霍夫氏病(Sandhoff disease)、 GM2激活病(GM2 activator disease)、克臘伯氏病(Krabbe disease)、 異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(metachromatic leukodystrophy)、 尼-皮二氏病 (Niemann-Pick disease) (A、 B和C型)、赫勒氏病(Hurler disease)、沙4尹氏病 (Scheie disease)、 Hunter病(Hunter disease)、桑菲歹寸普氏病(Sanfilippo disease)、 莫爾基奧氏病(Morquio disease)、馬-垃病(Maroteaux-Lamy disease)、透明質(zhì) 酸酶缺乏(hyaluronidase deficiency)、 天門冬酰氨酸葡萄糖胺尿癥 (aspartylglucosaminuria)、 巖藻糖香貝i積病(fbcosidosis)、 甘露糖香過多癥 (mannosidosis)、 'i射爾德氏病(Schindler disease)、 1型p垂液酸擊夾乏病(sialidosis typel)、旁姆普氏病、致密性成骨不全(Pycnodysostosis)、蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥 (ceroid lipofuscinosis)、膽固醇酯沉積病(cholesterol ester storage disease)、 烏 爾曼氏病(Wolman disease)、多發(fā)性硫酸酯酶缺乏(Multiple sulfatase deficiency)、乳液唾液異常增多(galactosialidosis)、粘月旨貯積病(mucolipidosis) (11、 III和IV型)、月光氨酸病(cystinosis)、唾液酸貯積病(sialic acid storage disorder)、伴有馬-斯二氏綜合征的乳糜微粒留滯病(chylomicron retention disease with Marinesco-Sj6gren syndrome)、 海-普二 氏綜合征 (I-Iermansky-Pudlak syndrome)、切-希二氏綜合征(Chediak-Higashi syndrome)、 Danon病(Danon disease)或Geleophysic發(fā)育不良(Geleophysic dysplasia), 代謝紊亂的癥狀多種多樣，并且可以包括如下的一種或多種，例如，貧 血、疲勞、容易挫傷(bruising easily)、血小板低、肝增大、脾增大、骨骼脆 弱(skeletal weakening)、肺損傷、感染(例如，胸部感染或肺炎)、腎損傷、進 行性腦損傷、發(fā)作、胎糞過厚、咳嗽、哮鳴、唾液或粘液過量產(chǎn)生、氣短 (shortness of breath)、腹痛、腸或消化道閉塞(occluded bowel or gut)、生育力 問題、鼻內(nèi)息肉、杵狀指/趾曱和皮膚(clubbing of the finger/toe nails and skin)、 手或扭卩疼痛(pain in the hands or feet)、血管角質(zhì)瘤(angiokeratoma)、 4非汗減少、 角月莫和晶狀體混法(corneal and lenticular opacities)、白內(nèi)障(cataracts)、 二尖瓣 垂牙口 /或回；危(mitral valve prolapse and/or regurgitation)、 心、臟月巴大 (cardiomegaly)、溫度不耐受、行走困難、吞咽困難、進行性視力喪失、進行性聽力喪失、張力減退、巨舌、反射消失、下腰痛、睡眠呼吸暫停、端坐呼 吸、嗜睡、脊柱前凸或脊柱側(cè)凸。應(yīng)理解的是，由于^:陷或缺乏蛋白質(zhì)和所 導(dǎo)致疾病表型(例如，代謝紊亂的癥狀顯現(xiàn))的不同性質(zhì)，給定病癥將通常^f又 出現(xiàn)對于特定病癥為特征性的癥狀。例如，患有法博氏病的患者可以出現(xiàn)上 述癥狀中的特定亞組，例如，但不限于，溫度不耐受、角膜眩暈(comeal whirling)、疼痛、皮滲、惡心或腹瀉?；加懈咝獱柺暇C合征(Gaucher syndrome) 的患者可以出現(xiàn)脾大、肝硬變、驚厥、張力過高、呼吸暫停、骨質(zhì)疏;^或皮 膚變色。 除了施用本文描述的一種或多種N-糖基化改變的分子，代謝紊亂也可 以通過適當?shù)臓I養(yǎng)和維生素(例如，輔因子療法)、物理療法和疼痛藥物療法 來治療。 依賴于給定代謝紊亂的特定性質(zhì)，患者可以在任何年齡出現(xiàn)這些癥狀。 在許多情況下，癥狀可以在兒童期或成人期早期出現(xiàn)。例如，法博氏病的癥 狀可以在年輕時(early age)出現(xiàn)，在10或11周歲的年齡。 如用于本文，'有風險發(fā)展出代謝紊亂'(例如本文所述的代謝紊亂)的受 試者是具有發(fā)展出紊亂的傾向(predisposition)的受試者，即，由于酶中的突 變而產(chǎn)生的發(fā)展出代謝紊亂的遺傳傾向，所述酶例如a-L-艾杜糖苷酸酶、 (3-D-半乳糖苷酶、|3-葡糖苷酶、J3-己糖胺酶、P-D-甘露糖苷酶、a-L-巖藻糖苷 酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、 a-N-乙酰半乳糖胺酶、天冬氨酰葡 糖胺酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、a-氨基葡糖苷-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、P-D-葡糖 醛酸酶、透明質(zhì)酸酶、a-L-甘露糖苷酶、a-神經(jīng)氨酸酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、酸性 脂肪酶、酸性神經(jīng)酰胺酶、鞘磷脂酶、硫酯酶、組織蛋白酶K或脂蛋白脂肪 酶。顯然，'有風險發(fā)展出代謝紊亂'的受試者不是感興趣的物種中的全部 受試者。 '疑似患有病癥'的受試者是具有病癥(例如，代謝紊亂或任何其它本 文所述的病癥)的一種或多種癥狀(例如，任何本文所述的那些癥狀)的受試者。 (ii)癌癥 癌癥是一類這樣的疾病或病癥，其特征在于細胞不受控制的分裂和這些 細胞擴散的能力，所述擴散或者通過侵入直接生長進入相鄰組織或者通過轉(zhuǎn)移植入遠距離位點(其中癌細胞經(jīng)過血流或淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)運)。癌癥可以侵襲各 個年齡的人，但是風險有隨年齡增加的趨勢。癌癥的類型可以包括，例如， 肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、腎癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液癌(hematological cancer)、神經(jīng)組織癌(neural tissue cancer)、黑素瘤、曱狀腺癌、卵巢癌、睪 丸癌、前列腺癌、宮頸癌、陰道癌或膀胱癌。 如用于本文，'有風險發(fā)展出癌癥，，的受試者是具有發(fā)展出癌癥的傾向 的受試者，即，發(fā)展出癌癥的遺傳傾向，例如，腫瘤抑制基因中的突變(例 如，BRCA1、 p53、 RB或APC中的突變)或已經(jīng)曝露于能夠?qū)е掳┌Y的條件。 因此，當受試者已經(jīng)曝露于誘變或致癌水平的特定化合物(例如，香煙煙霧 中的致癌化合物例如丙烯醛、砷、苯、苯并蒽(Benz{a}anthracene)、苯并芘 (Benzo{a}pyrene)、釙-210 (氡)、氨基甲酸酉旨(Urethane)或氯乙烯)時，所述受 試者也可以是'有風險發(fā)展出癌癥，，的受試者。此外，當受試者已經(jīng)曝露于 例如大劑量的紫外線或X線輻射或曝露于(例如感染)引起腫瘤/與腫瘤相關(guān) 的病毒如乳頭狀瘤病毒、EB病毒(Epstein-Barr vims)、乙型肝炎病毒或人T-細胞白血病-淋巴瘤病毒時，所述受試者可以是'有風險發(fā)展出癌癥，，的受 試者。從上文可以清楚的是'有風險發(fā)展出癌癥，，的受試者不是感興趣的物 種中的全部受試者。 '疑似患有癌癥'的受試者是具有癌癥的一種或多種癥狀的受試者。癌 癥的癥狀是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且包括，但不限于，乳腺肺塊、乳頭變 化、乳腺嚢中、乳腺疼痛、體重減輕、虛弱、過度疲勞、進食困難、食欲喪 失、久咳、惡化的呼吸急促(worseningbreathlessness)、咳血、血尿、血{更、 惡心、嘔吐、肝轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、腹脹、氣脹、腹膜腔積液(fluid in peritoneal cavity)、陰道出血、便秘、腹脹、結(jié)腸穿孔、急性腹膜炎(感染、 發(fā)熱、疼痛)、疼痛、吐血、大量出汗(heavy sweating)、發(fā)熱、高血壓、貧血、 腹瀉、黃疸、眩暈、寒戰(zhàn)、肌肉痙攣、結(jié)腸轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移、膀胱轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn) 移、骨轉(zhuǎn)移、腎轉(zhuǎn)移和胰腺轉(zhuǎn)移、吞咽困難等。 除了施用一種或多種本文所述的N-糖基化改變的分子，也可以通過化 療劑、電離輻射、免疫治療劑或超高溫治療劑來治療癌癥?；焺┌ǎ?,'頃4白(cisplatin)、 卡4白(carboplatin)、 丙卡巴肼(procarbazine)、 氮芥 (mechlorethamine)、 環(huán)石壽酰胺(cyclophosphamide)、 喜樹威(camptothecin)、 阿 霉素(adriamycin)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、美法侖(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安、亞硝基脲、放線菌素D (dactinomycin)、柔紅霉素 (daunorubicin)、 多柔比星(doxorubicin)、 博來霉素(bleomycin)、 普卡霉素、 絲裂霉素(mitomycin)、 依托泊普(etoposide) 、 verampil 、 鬼臼毒素 (podophyllotoxin)、 4也莫昔芬(tamoxifen)、 ^'斥》醇(taxo1)、 (transplatinum)、 5-氟尿嘧咬(5-flurouracil)、長春新石威(vincristin)、長春石成(vinblastin)和甲氨蟲萊。令 (methotrexate)。 (iii)炎性病癥 如用于本文，'炎性病癥'是指其中一種或多種物質(zhì)(例如，非天然存在 于受試者中的物質(zhì))，藉由白細胞(例如，B細胞、T細胞、巨噬細胞、單核 細胞或樹突細胞)的作用，不適當?shù)匾l(fā)病理學應(yīng)答(例如，病理學免疫應(yīng)答) 的過程。因此，所述炎性應(yīng)答中涉及的這些細胞稱作'炎性細胞'。不適當 菌)存在于受試者中或受試者上的應(yīng)答。不適當?shù)匾l(fā)的應(yīng)答可以是其中自 身成分(例如，自體抗原)被炎性細胞靶向的應(yīng)答(例如，自身免疫病如多發(fā)性 例如，過敏反應(yīng)。因此，不適當?shù)匾l(fā)的應(yīng)答的原因可以是存在微生物感染 (例如，病毒、細菌或真菌的)。炎性病癥的類型(例如，自身免疫病)可以包 括，但不限于，骨關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis (RA))、脊推 關(guān)節(jié)病(spondyloarthropathies)、 POEMS綜合征(POEMS syndrome)、克朗氏 病(Crohn's disease)、 多中心性卡斯爾氏病(multicentric Castleman，s disease)、 系統(tǒng)性紅斑狼齊(systemic lupus erythematosus (SLE))、多發(fā)性硬化(MS)、肌 營養(yǎng)不良(muscular dystrophy (MD))、胰島素依賴性糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM))、 皮月幾炎(dermatomyositis)、 多月幾炎(polymyositis)、 炎性4申經(jīng)病(inflammatory neuropathies)例3口歸伯二氏綜合^正(Guillain Barre syndrome)、 脈管炎(vasculitis)例如韋格納肉芽月中病(Wegener's granulomatosus)、 結(jié)節(jié)性多動脈炎(polyarteritis nodosa)、 風濕性多月幾痛 (polymyalgia rheumatica)、 顳動脈炎(temporal arteritis)、 舍格倫綜合征 (Sjogren's syndrome)、 貝賽特氏病(Bechet，s disease)、 丘-施二氏綜合j正 (Churg-Strauss syndrome)或高安氏動脈炎(Takayasu，s arteritis),炎性病癥還包 括特定類型的變態(tài)反應(yīng)例如鼻炎(rhinitis)、鼻竇炎(sinusitis)、蕁麻疹 抗原、病毒、細菌、真 硬化)。(urticaria)、 尋麻滲(hives)、血管性7jc月中(angioedema)、 特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis)、食物變態(tài)反應(yīng)(food allergies)(例如，(堅果變態(tài)反應(yīng)(nut allergy))、 藥物變態(tài)反應(yīng)(drug allergies)(例如，青霉素)、昆蟲變態(tài)反應(yīng)(insect allergies) (例如，針對蜂螫的變態(tài)反應(yīng))或肥大細胞病(mastocytosis)。炎性病癥也可包 括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis)和哮喘(asthma)。 '有風險患上炎性病癥'的受試者是指具有一種或多種炎性病癥的家族 史(例如， 一種或多種炎性病癥的遺傳傾向)的患者或曝露于一種或多種炎癥 誘導(dǎo)條件的受試者。例如，受試者可能已經(jīng)曝露于病毒或細菌超抗原，例如， 但不限于，葡萄球菌腸毒素(staphylococcalenterotoxins)(SEs)、酉良膿鏈球菌夕卜 毒素(streptococcus pyogenes exotoxin) (SPE)、金黃色葡萄球菌中毒性休克-綜 合征毒素(staphylococcus aureus toxic shock-syndrome toxin) (TSST-1)、鏈球菌 促有絲分裂外毒素(streptococcal mitogenic exotoxin) (SME)和鏈球菌超抗原 (streptococcal superantigen) (SSA)。從上文可以清楚的是'有風險發(fā)展出炎性 病癥'的受試者不是感興趣的物種中的全部受試者。 '疑似患有炎性病癥'的受試者是出現(xiàn)炎性病癥的一種或多種癥狀的受 試者。炎性病癥的癥狀是本領(lǐng)域熟知的并且包括，但不限于，發(fā)紅、腫脹(例 如，關(guān)節(jié)肺脹)、觸石並發(fā)熱的關(guān)節(jié)(jointsthatare warm to the touch)、關(guān)節(jié)痛、 僵硬、關(guān)節(jié)功能喪失、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、疲勞、精力喪失(lossofenergy)、頭痛、 食欲喪失、肌肉僵硬、失眠、瘙癢、鼻塞、噴嚏、咳嗽、 一種或多種神經(jīng)學 癥狀如眩暈、發(fā)作或疼痛。 除了施用一種或多種本文所述的N-糖基化改變的分子之外，炎性病癥 也可以通過非類固醇抗炎藥(NSAID)、緩解病情的抗風濕藥(DMARD)、生物 反應(yīng)調(diào)節(jié)劑或皮質(zhì)類固醇來治療。生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑包括，例如，抗TNF劑(例 如，可溶性TNF受體或?qū)NF特異性的抗體如adulimumab、英夫利昔單抗 (infliximab)或依刃卩西普(etanercept) 使用N-糖基化改變的分子(或其藥物組合物)、適用于治療(例如，預(yù)防 藥物組合物和治療方法 N-糖基化改變的分子(例如，目標分子如目標蛋白的改變的N-糖基化形 式)可以并入藥物組合物，所述藥物組合物含有治療有效量的所述分子和一 58種或多種佐劑、賦形劑、載體和/或稀釋劑?？山邮艿南♂寗⑤d體和賦形劑 通常不負面影響受體的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)(例如電解質(zhì)平衡)?？山邮艿妮d體包括生物 相容性、惰性或生物可吸收的鹽、緩沖劑、寡糖或多糖、聚合物、粘度改善 齊'J(viscosity-improving agent)、防腐劑等。 一種示例性載體是生理鹽水(0.15 M NaCl, pH 7.0-7.4)。另 一種示例性載體是50 mM磷酸鈉、100mM氯化鈉。 關(guān)于配制和施用藥物組合物的技術(shù)的進一步細節(jié)可以在例如Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa.)中找到。也可以將 輔助性活性化合物(supplementary active compound)并入組合物中。 含有N-糖基化改變的分子的藥物組合物的施用可以是系統(tǒng)的或局部的。 可以將藥物組合物這樣配制，即令它們適用于胃腸外和/或非胃腸外施用。具 體使用方式(administrationmodality)包括皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng) 皮、鞘內(nèi)、口服、直腸、口腔、局部、鼻、眼、關(guān)節(jié)內(nèi)、動脈內(nèi)、蛛網(wǎng)膜下、 支氣管、淋巴、陰道和子宮內(nèi)施用。 施用可以通過定期注射所述藥物組合物的推注(bolus)，或者可以是不間 斷或連續(xù)地通過從外部儲器(reservoir)(例如，IV包)或內(nèi)部儲器(例如，生物 可腐蝕性植入物(bioerodable implant)、生物人工器官(bioartificial organ)或植 入的產(chǎn)生N-糖基化改變的分子的細胞集落)進行靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用。參見， 例如，美國專利Nos. 4，407，957、 5,798,113和5,800,828,將它們通過所述整 體并入本文。藥物組合物的施用可以使用合適的遞送手,爻(delivery means)來 實現(xiàn)，所述遞送手,殳例如泵(參見，例如，Annals of Pharmacotherapy, 27:912 (1993); Cancer, 41:1270 (1993); Cancer Research, 44:1698 (1984)，通過所述 整體并入本文)；微嚢化(參見，例如，美國專利Nos. 4,352,883; 4,353,888; 和5,084,350,通過所述整體并入本文)；連續(xù)釋放聚合物植入物(continuous release polymer implant)(參見，例如，Sabel，美國專利No. 4,883,666,通過 所述整體并入本文)；大囊化(macroencapsulation)(參見，例如，美國專利Nos. 5,284,761、 5,158,881 、 4,976,859和4,968,733，和/>開的PCT專利申請 W092/19195、 WO 95/05452,將它們每一篇的公開內(nèi)容通過所述整體并入本 文)；皮下、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肌肉內(nèi)注射或注射至其它合適部位；或在膠 嚢、液體、片劑、丸劑(pill)或延長釋放制劑(prolonged release formulation)中 口月l施用。 胃腸外遞送系統(tǒng)的實例包括乙埽-乙酸乙烯共聚物顆粒、滲透泵(osmoticpump)、可才直入輸注系統(tǒng)(implantable infbsion system)、泵遞送(pump delivery)、 嚢j匕纟田月包遞送(encapsulated cell delivery)、月旨質(zhì)體遞送(liposomal delivery)、 4十 遞送注射(needle-delivered injection)、無針注射(needle-less injection)、噴霧器 (nebulizer)、 霧化器(aerosolizer)、 電穿孑L和經(jīng)皮貝占片(transdermal patch)。 適合于胃腸外施用的制劑通常含有N-糖基化改變的分子的無菌含水制 備物，其優(yōu)選與受體的血液等滲(例如，生理鹽水溶液)。制劑可以以單位劑 量或多劑量形式存在。 適合于口服施用的制劑可以作為離散單位如膠嚢、扁嚢劑(cachet)、片劑 或錠劑(lozenges)存在，其各自含有預(yù)定量的N-糖基化改變的分子；或含水 液體中或非水液體中的懸液，如糖漿、酏劑、乳劑或飲劑(draught)。 可以將適合于局部施用的N糖基化改變的分子(例如，目標分子例如目 標蛋白的改變的N-糖基化形式)向哺乳動物(例如，人患者)作為例如乳膏 (cream)、噴霧、泡沫、凝膠、軟膏(ointment)、油膏(salve)或干燥摩擦劑(dry mb) 施用。干燥摩擦劑可以在施用部位再水合。N-糖基化改變的分子也可以直接 注入(例如，浸入并干燥)其后可以進行局部應(yīng)用的繃帶、紗布或貼片。也可 以將N-糖基化改變的分子以半液態(tài)、凝膠(gelled)態(tài)或完全液態(tài)保持在用于 局部施用的繃帶、紗布或貼片中(參見，例如，美國專利No. 4,307,717，將 其內(nèi)容通過所述整體并入本文)。 可以向需要的受試者以本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定的給藥方案施用治療 有效量的藥物組合物。例如，可以向受試者施用組合物，例如，以每劑 0.01|ig/kg-10，000嗎/kg受試者體重的劑量系統(tǒng)性施用。在另 一實例中，劑量 是每劑1嗎/kg-100pg/kg受試者體重。在另一實例中，劑量是每劑1 pg/kg-30 叫/kg受試者體重，例如，每劑3pg/kg-10嗎/kg受試者體重。 為了優(yōu)化治療效力，可以首先以不同的給藥方案施用N-糖基化改變的 分子。單位劑量和方案依賴于多種因素，包括，例如，哺乳動物的種類、其 免疫狀態(tài)、哺乳動物的體重。通常，組織中N-糖基化改變的分子的水平可 以使用適合的、作為臨床測試流程一部分的篩查測定法監(jiān)測，例如，來測定 給定治療方案的效力。 N-糖基化改變的分子的給藥頻率在醫(yī)療工作者(medical practitioner)(例 如，醫(yī)生或護士)的技術(shù)和臨床判斷范圍之內(nèi)。通常，施用方案通過臨床試 驗建立，所述試驗可以建立最適施用參數(shù)。然而，從業(yè)者可以根據(jù)受試者的 60年齡、健康、重量、性別和醫(yī)療狀態(tài)改變這些治療方案。給藥頻率可以依賴 于治療是預(yù)防性還是治療性的而變化。 這些N-糖基化改變的分子(例如，目標分子例如目標蛋白的改變的N-糖 基化形式)或其藥物組合物的毒性和治療效力可以通過已知的藥學方法在例 如細胞培養(yǎng)物或?qū)崱€動物中測定。這些方法可以用于例如測定LD50 (對群體 的50。/。致死的劑量)和ED50(在群體的50%中治療有效的劑量)。毒性和治療 效果的劑量比是治療指數(shù)并且可以表示為LD50/ED50的比例。展現(xiàn)高治療 指數(shù)的藥物組合物是優(yōu)選的。盡管可以使用展現(xiàn)毒性副作用的藥物組合物， 應(yīng)該注意設(shè)計使這些化合物靶向患病組織的部位以盡量減小對正常細胞的 損害(例如，非靶細胞)，并且由此降低副作用。 從細胞培養(yǎng)測定法和動物研究獲得的數(shù)據(jù)可以用于配制用于適當受試 者(例如，人患者)中的劑量范圍。這些藥物組合物的劑量通常在如下循環(huán)濃 度的范圍內(nèi)，所述濃度包括ED50且?guī)缀鯚o毒或無毒。劑量可以在這個范圍 內(nèi)依賴于采用的劑量形式和使用的施用途徑而變化。對于如本文所述使用的 藥物組合物(例如，用于治療受試者中的代謝紊亂)，最初可以從細胞培養(yǎng)測 定法估計治療有效劑量。可以在動物模型中配制劑量以實現(xiàn)包括在細胞培養(yǎng) 物中測定的IC50(即，實現(xiàn)對癥狀的最大抑制的一半的藥物組合物濃度)的循 環(huán)血漿濃度范圍。這種信息可以用于更精確地測定在人中有用的劑量。血漿 中的水平可以例如通過高效液相層析測量。 如本文所定義的，'治療有效量，，的N-糖基化改變的分子是能夠在受治 療的受試者中產(chǎn)生期望的醫(yī)學結(jié)果的分子的量(例如，改善代謝紊亂的 一種 或多種癥狀或減少癌細胞增殖)。N-糖基化改變的分子的治療有效量(即，有 效劑量)包括毫克或」微克量的所述化合物每千克受試者或樣品重量(例如，約 1微克每千克至約500毫克每千克，約IOO微克每千克至約5毫克每千克， 或約1微克每千克至約50微克每千克)。 受試者可以是任何哺乳動物，例如，人(例如，人患者)或非人靈長類(例 如，黑猩猩(chimpanzee)、狒狒(baboon)或猴(monkey))、小鼠、大鼠、兔、豚 鼠、沙鼠、倉鼠、馬、牲畜類型(例如，牛、豬、綿羊或山羊)、犬、貓或鯨。 可以將本文描述的N-糖基化改變的分子或其藥物組合物與另 一 治療作 為聯(lián)合療法向受試者施用，所述另一治療例如用于代謝紊亂(例如，溶酶體 貯積病)的治療。例如，聯(lián)合療法可以包括向受試者(例如，人患者)施用一種或多種額外的為受試者提供治療益處的劑(agent)，所述受試者患有或有風險 發(fā)展出(或疑似患有)代謝紊亂(例如，溶酶體貝i積病)。由此，化合物或藥物 組合物和所述一種或多種額外的劑同時施用?；蛘?，可以首先及時(intime) 施用N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質(zhì)或多碎醇)，并其次及時施用所述一 種或兩種額外的劑?？梢允紫燃皶r施用所述一種或兩種額外的劑，并其次及 時施用N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質(zhì)或多辟醇)。N-糖基化改變的分子 可以替代或加強先前施用或當前施用的療法。例如，當用本發(fā)明的N-糖基 化改變的分子治療時， 一種或多種額外的劑的施用可以停止或減少，例如， 以較低水平施用。也可以保持先前療法的施用。在一些情況下，可以將先前 療法保持到N-糖基化改變的分子的水平(例如，劑量或進度(schedule))達到足 以提供治療效果的水平?？梢月?lián)合施用兩種療法。 應(yīng)該理解的是在先前治療有特定毒性的情況(例如，具有顯著副作用譜 的用于代謝紊亂的治療)下，N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質(zhì)或多萜醇) 的施用可以用于將先前治療的量抵消和/或減少到足以給出相同或改進的治 療益處、但是沒有毒性的水平。 在一些情況下，當向受試者施用本發(fā)明的N-糖基化改變的分子(例如， 蛋白質(zhì)、多薛醇或與多碎醇連接的脂質(zhì))或藥物組合物時，將第一種療法中 斷?？梢员O(jiān)測受試者的第一種預(yù)先選擇的結(jié)果，例如，代謝紊亂的一種或多 種癥狀的改善，例如任何本文所述的那些(見上文)。在一些情況下，在觀察 到第一種預(yù)先選擇的結(jié)果的情況下，減少或中斷使用N-糖基化改變的分子 (例如，N-糖基化改變的蛋白質(zhì)或N-糖基化改變的多碎醇)的治療。然后在 使用N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質(zhì)或多碎醇)的治療之后，可以監(jiān)測受 試者第二種預(yù)先選擇的結(jié)果，例如，代謝紊亂的癥狀的惡化。當觀察到所述 第二種預(yù)先選定的結(jié)果時，可以恢復(fù)或增加向受試者施用N-糖基化改變的 分子(例如，蛋白質(zhì)或多萜醇)，或恢復(fù)所述第一種治療的施用，或?qū)κ茉囌?施用N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質(zhì)、多萜醇或與多萜醇連接的脂質(zhì)) 和第一種治療二者或量增加的N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質(zhì)或多碎醇) 和所述第一種治療方案。 N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質(zhì)或多萜醇)也可以與用于疾病(例如， 代謝紊亂)的一種或多種癥狀的治療一起施用。例如，N-糖基化改變的分子(例 如，蛋白質(zhì)、多萜醇或與多萜醇連接的脂質(zhì))可以與例如疼痛用藥(painmedication)共同施用(例如，同時或通過上述聯(lián)合方案)。 應(yīng)該理解的是在一些實施方案中，N-糖基化改變的分子是其中改變的糖基化使所述分子產(chǎn)生醫(yī)學相關(guān)產(chǎn)物的能力增加的分子。例如，N-糖基化改變的分子可以是能夠產(chǎn)生治療性產(chǎn)物(例如，小分子或治療性肽)的酶，所述酶的活性通過糖基化增加或優(yōu)化。這些產(chǎn)物和使用所述產(chǎn)物的方法在本公開的范圍之內(nèi)。 本文所述的任何藥物組合物可以與施用說明書一起包括在容器、包裝或散發(fā)器(dispenser)中。 以下是本發(fā)明的實踐的實施例。不應(yīng)將它們理解為以任何方式對本發(fā)明范圍的限制。 實施例 實施例1.質(zhì)粒、引物和菌抹 表l含有在本文所述實驗中所用載體(例如，表達載體)和缺失盒的構(gòu)建中使用的全部質(zhì)粒的列表。在所述實驗中使用了解脂西洋蓍霉的MTLY60菌林。 表2含有在以下實施例中使用的引物(引物的名稱)和引物應(yīng)用的列表。 表l_
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