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專(zhuān)利名稱(chēng)真菌發(fā)酵生產(chǎn)天然脫落酸的新方法 技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于用真菌發(fā)酵法生產(chǎn)天然活性脫落酸的發(fā)酵工程。 脫落酸(Abscisic Acid，簡(jiǎn)稱(chēng)ABA)是目前世界上已發(fā)現(xiàn)的五大植物荷爾蒙之一。天然型的ABA由于對(duì)農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育具有很強(qiáng)的調(diào)控活性，能促進(jìn)果實(shí)類(lèi)、谷類(lèi)、豆類(lèi)的成熟發(fā)育，能大幅度提高其產(chǎn)量和質(zhì)量，又能大大增強(qiáng)其耐寒、抗旱和耐鹽能力，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，ABA在基礎(chǔ)領(lǐng)域的研究已深入到植物細(xì)胞與基因工程水平。然而，由于存在于植物體內(nèi)的天然活性ABA光學(xué)構(gòu)型僅為(S)-(+)-ABA，單純的(S)-(+)-ABA的生產(chǎn)成本極高，售價(jià)昂貴，而人工合成的ABA，得到的是Racemid型，活性遠(yuǎn)小于天然型的ABA，因此，ABA應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)幾乎是空談。為了解決和滿(mǎn)足ABA應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的問(wèn)題，近二十年來(lái)，國(guó)外開(kāi)始利用微生物發(fā)酵法來(lái)生產(chǎn)天然活性脫落酸。1977年，意大利G.Assante首先采用Cercospora Rosicola發(fā)酵生產(chǎn)天然活性脫落酸，主要為固體發(fā)酵，但由于其產(chǎn)量很低，其商品價(jià)格很高(193.4美元/毫克)，1982年，日本的丸茂晉吾發(fā)現(xiàn)利用真菌Botrytis Cinerea可生產(chǎn)天然活性ABA，并申請(qǐng)了專(zhuān)利，其后，于1987，1988，1990年，日本東麗公司和新日本化學(xué)工業(yè)公司的松本俊一等、相繼用Botrytis菌株生產(chǎn)天然活性脫落酸，申請(qǐng)了六項(xiàng)專(zhuān)利，生產(chǎn)工藝分別為固體發(fā)酵，也育液體搖瓶發(fā)酵，同時(shí)采用了纖維素泡沫作載體的液體發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)量已由15-20mg/升培養(yǎng)基提高到23.8-85mg/升發(fā)酵液，最高的產(chǎn)量已達(dá)300mg/L。但以上的專(zhuān)利還存在①發(fā)酵產(chǎn)量低；②發(fā)酵工藝尚局限于固體發(fā)酵和液體批次發(fā)酵，沒(méi)有充分利用菌體連續(xù)產(chǎn)生脫落酸的特性。菌體在一個(gè)固定的培養(yǎng)環(huán)境中生長(zhǎng)，產(chǎn)酸，當(dāng)產(chǎn)物(脫落酸)達(dá)到一定濃度時(shí)，產(chǎn)生抑制作用，菌體不再分泌產(chǎn)物，造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、菌體和能源的浪費(fèi)，使產(chǎn)量不能提高，生產(chǎn)效率低，成本高。仍然不能解決應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的問(wèn)題。 本發(fā)明的任務(wù)是尋找一個(gè)能大幅度提高脫落酸產(chǎn)量的新工藝，大幅度降低脫落酸的生產(chǎn)成本，使工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)成為可能。 本發(fā)明的技術(shù)解決方案1.改造現(xiàn)有的脫落酸產(chǎn)生菌株為高產(chǎn)菌株，大幅度提高菌種的發(fā)酵活性。 2.改液體批次發(fā)酵工藝為固定化菌體連續(xù)流加補(bǔ)料、出料、PH控制的(起始PH控制、生長(zhǎng)期PH控制、生產(chǎn)期PH控制、發(fā)酵終了期PH控制)發(fā)酵工藝。 3.選擇更適合于菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)酸的培養(yǎng)基配方。 4.通過(guò)添加關(guān)鍵底物、周控菌體發(fā)酵的代謝途徑，大幅度提高脫落酸產(chǎn)量。 本發(fā)明使用的菌種為Botrytis Cinerea-Cercospoxa RosicolaFD338(簡(jiǎn)稱(chēng)B.C.FD338)。該菌是用葡萄孢霉屬菌株Botrytis CinereaT-1進(jìn)行原生質(zhì)體誘變后再同另一脫落酸產(chǎn)生菌Cercospora Rosicola216進(jìn)行原生質(zhì)體融合及相關(guān)遺傳誘變處理所獲得的高產(chǎn)脫落酸菌株。 本發(fā)明采用三級(jí)連續(xù)發(fā)酵，根據(jù)三級(jí)不同要求，選擇了三種不同的培養(yǎng)基A、B、C。其組成為培養(yǎng)基A葡萄糖0.2-2％ 牛肉膏0.1-1％ 酵母膏0.1-1％甘露糖0.1-0.5％ 麥芽汁5-20％ 玉米漿0.001-0.05％(或蔗糖0.1-0.5％，鼠李糖0.1-0.5％，蛋白胨0.1-1％ 甘油0.1-1％， 生物素0.001-0.05％)NH4NO30.1-0.5％ MgSO40.05-0.3％，KCl 0.1-0.3％K2HPO40.05-0.5％培養(yǎng)基B米糠汁20-70％(或淀粉0.5-5％，糊精0.1-2％)廢糖蜜0.5-7％(或纖維二糖0.5-5％，或乳糖0.5-5％或半乳糖0.5-5％，蔗糖0.1-3％)豆餅粉0.1-2％(或花生餅粉0.1-2％，或棉籽餅粉0.1-3％)谷氨酸0.01-0.5％，(NH4)2SO40.01-0.8％ (或尿素0.1-1％)MgSO40.05-0.3％ KCl 0.1-0.3％ 硫胺素0.0001-0.05％培養(yǎng)基C糊精0.1-3％麥麩汁20-70％(或玉米粉0.1-3％)葡萄糖0.5-5％(或蔗糖0.5-1.0％ 或廢糖蜜0.5-7％或乳糖0.1--7％，或半乳糖0.1-7％棉籽餅粉0.1-2％(或豆餅粉0.1-8％，乳清0.1-9％，或花生餅粉0.1-8％)柑桔汁0.5-5％(或纖維二糖0.5-15％，或甘油0.1-5％，或豆油0.5-5％，或檸檬酸鈉0.1-5％)谷氨酸0.01-5％(或半胱氨酸0.01-5％，或谷氨酸+半胱氨酸0.01-5％)(NH4)2SO40.01-5％(或NH4NO30.1-7％，或NaNO30.1-7％，或氨0.1-7％)硫胺素0.001-0.5％(或玉米素0.001-0.5％)MgSO40.05-0.5％ NaCl 0.05-0.5％ FeSO40.05-0.5％ CuSO40.05-0.5％硼、鉬、鈷、鎳等微量元素(0.1-100μmol/L)本發(fā)明的發(fā)酵過(guò)程為將活化后的菌種接種于培養(yǎng)基A中，在三角瓶?jī)?nèi)搖瓶培養(yǎng)24-72小時(shí)后，以5-10％的接種量接種于已放有培養(yǎng)基B的種子罐中發(fā)酵培養(yǎng)24-60小時(shí)，然后仍按5-10％的接種量接種于三級(jí)發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。三級(jí)發(fā)酵罐以培養(yǎng)基C作為發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)液，并于罐體中加入微孔陶瓷材料，(或微孔網(wǎng)膜、煤渣、聚氨酯泡沫，磚渣或海藻酸鈉，聚乙烯醇、明膠等)將菌體固定化處理。在三級(jí)發(fā)酵過(guò)程中，待菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)，通過(guò)降低溶解氧濃度、降低發(fā)酵溫度手段降低菌體生長(zhǎng)速率，并連續(xù)低濃度流加培養(yǎng)基C及添加前體底物，定時(shí)定量出料。將發(fā)酵后的發(fā)酵液用有機(jī)溶劑萃取法，離子交換柱法，硅膠柱層折法及活性炭吸附法等提取后，即得白色純品脫落酸。 在發(fā)酵系統(tǒng)添加的前體底物主要有咪唑，嗎啉，吡啶及其衍生物，乙酰胺、乙酸胺，β.β-二甲酰酸，咾啉，甲羥戊酸中的任一種。 提取過(guò)程中所用的試劑為甲醇、乙醇、乙酸乙脂、丙酮、氯仿、乙醚、環(huán)乙烷，石油醚等低級(jí)醇。離子交換柱所用的樹(shù)脂為強(qiáng)堿陰離子樹(shù)脂，也可為大孔樹(shù)脂。發(fā)酵條件溫度10℃-40℃ PH3-12PH調(diào)控用流加氨或加入CaCO3或加入NaOH、KOH的方式進(jìn)行發(fā)酵時(shí)間1-30天，前體底物添加量0.1-16％本發(fā)明的整個(gè)工藝流程見(jiàn)附圖  。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)①生產(chǎn)菌種的產(chǎn)量較目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的最高產(chǎn)量高3-4倍(日本專(zhuān)利最高為300mg/L發(fā)酵液，本菌種B.C.FD338產(chǎn)量為900-1200mg/L發(fā)酵液)； ②發(fā)酵系統(tǒng)采用固定化技術(shù)，避免了菌體在連續(xù)進(jìn)料出料過(guò)程的流失，使產(chǎn)酸量穩(wěn)定；③發(fā)酵系統(tǒng)在產(chǎn)酸期能穩(wěn)定10-30天，從而大大提高了生產(chǎn)效率，降低了能耗和原料使用量，使生產(chǎn)成本大幅度降低。 ④關(guān)鍵前體底物的添加，促進(jìn)了發(fā)酵代謝正向順利進(jìn)行，大幅度提高了產(chǎn)量。 實(shí)施例用1000ml三角瓶10個(gè)，每瓶裝300ml培養(yǎng)基A于120℃滅菌，冷卻后，接種活化后的B.C.FD338菌孢子懸液，置于25℃-28℃溫度下的搖床上，搖瓶培養(yǎng)24-72小時(shí)。 將培養(yǎng)好的一級(jí)種子液按5％接種量接種于內(nèi)裝50升培養(yǎng)基B的100立升發(fā)酵罐中，在24-28℃溫度下通氣攪拌培養(yǎng)24-60小時(shí)。 用1噸發(fā)酵罐作三級(jí)罐發(fā)酵。罐內(nèi)裝培養(yǎng)基C750立升及微孔陶瓷珠(粒徑0.9-160mm3，1.0-5g/L)，用常規(guī)高壓熱蒸氣滅菌后，按5％接種量接種二級(jí)種子液，通氣攪拌48小時(shí)，然后通入氨將PH控制在4-8，降低溶解氧濃度(降低通氣量)，降低發(fā)酵溫度至10-25℃以0.01-5L/小時(shí)的速度流加培養(yǎng)基C，以0.1％-16％的比例加入甲羥戊酸，使發(fā)酵系統(tǒng)狀態(tài)穩(wěn)定，每隔10小時(shí)出料一次。將所出的液料以離子交換樹(shù)脂法回收發(fā)酵液中的產(chǎn)品，并用乙醇洗滌，得白色結(jié)晶狀脫落酸產(chǎn)品。旋光度[α]D28＝+419°。 經(jīng)檢測(cè)發(fā)酵系統(tǒng)經(jīng)過(guò)25天的穩(wěn)定產(chǎn)酸，產(chǎn)量可達(dá)1.2克脫落酸/升發(fā)酵液。經(jīng)離子交換法回收，產(chǎn)品回收率達(dá)80％。 權(quán)利要求 1 用真菌發(fā)酵生產(chǎn)天然活性脫落酸的新方法，其特征發(fā)酵采用三級(jí)連續(xù)發(fā)酵，真菌固定化工藝。在第三級(jí)發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)控制營(yíng)養(yǎng)成分(流加培養(yǎng)基C)、控制溶解氧濃度、溫度、PH等來(lái)穩(wěn)定產(chǎn)酸量，并定時(shí)定量出料。提取工藝采用有機(jī)溶劑萃取，離子交換，柱層析及吸附法。整個(gè)工藝流程見(jiàn)附圖。 2 按照權(quán)利要求1所述的真菌發(fā)酵生產(chǎn)天然活性脫落酸的方法，其特征是三級(jí)連續(xù)發(fā)酵的培養(yǎng)基分別為一級(jí)培養(yǎng)基為A，二級(jí)培養(yǎng)基為B，三級(jí)培養(yǎng)基為C，其組成為培養(yǎng)基A葡萄糖0.2-2％ 牛肉膏0.1-1％酵母膏0.1-1％甘露糖0.1-0.5％ 麥芽汁5-20％ 玉米漿0.001-0.05％(或蔗糖0.1-0.5％，鼠李糖0.1-0.5％，蛋白胨0.1-1％甘油0.1-1％， 生物素0.001-0.05％)NH4NO30.1-0.5％MgSO40.05-0.3％，KCl 0.1-0.3％K2HPO40.05-0.5％培養(yǎng)基B米糠汁20-70％(或淀粉0.5-5％，糊精0.1-2％)廢糖蜜0.5-7％(或纖維二糖0.5-5％，或乳糖0.5-5％或半乳糖0.5-5％，蔗糖0.1-3％)豆餅粉0.1-2％(或花生餅粉0.1-2％，或棉籽餅粉0.1-3％)谷氨酸 0.01-0.5％ (NH4)2SO40.01-0.8％ (或尿素0.1-1％)MgSO40.05-0.3％ KCl 0.1-0.3％ 硫胺素0.0001-0.05％培養(yǎng)基C糊精0.1-3％ 麥麩汁20-70％(或玉米粉0.1-3％)葡萄糖0.5-5％(或蔗糖0.5-1.0％ 或廢糖蜜0.5-7％或乳糖0.1--7％，或半乳糖0.1-7％棉籽餅粉0.1-2％(或豆餅粉0.1-8％，乳清0.1-9％，或花生餅粉0.1-8％)柑桔汁0.5-5％(或纖維二糖0.5-15％，或甘油0.1-5％，或豆油0.5-5％，或檸檬酸鈉0.1-5％)谷氨酸0.01-5％(或半胱氨酸0.01-5％，或谷氨酸+半胱氨酸0.01-5％)(NH4)2SO40.01-5％(或NH4NO30.1-7％，或NaNO30.1-7％，或氨0.1-7％)硫胺素0.001-0.5％(或玉米素0.001-0.5％)MgSO40.05-0.5％ NaCl 0.05-0.5％FeSO40.05-0.5％ CuSO40.05-0.5％硼、鉬、鈷、鎳等微量元素0.1-100μmol/L 3按照權(quán)利要求2所述的真菌發(fā)酵生產(chǎn)天然活性脫落酸的新方法，其特征是一級(jí)種子接種于二級(jí)種子，二級(jí)種子接種于三級(jí)發(fā)酵罐，其接種量均為5-10％。 4按權(quán)利要求1或2所述的真菌發(fā)酵生產(chǎn)天然脫落酸的新方法，其特征是用于固定真菌的材料為微孔陶瓷(或海藻酸鈉，聚乙烯醇、明膠、微孔網(wǎng)膜，煤渣磚渣，聚氨酯泡沫等)。 5按照權(quán)利要求3所述的真菌發(fā)酵生產(chǎn)天然脫落酸的新方法，其特征是三級(jí)發(fā)酵系統(tǒng)中添加的前體底物主要為咪唑，嗎啉，吡啶及其衍生物，乙酰胺，乙酸胺，β、β-二甲酰酸，咾啉，甲羥戊酸等中的任一種，添加量為0.1-16％。 6按權(quán)利要求1或5所述的真菌發(fā)酵生產(chǎn)脫落酸的新方法，其特征是提取工藝中，所用的洗脫劑為低級(jí)醇類(lèi)。 7按權(quán)利要求2或4所述的真菌發(fā)酵生產(chǎn)天然脫落酸的新方法，其特征是發(fā)酵條件為溫度10℃-40℃，PH3-12，PH調(diào)控用流加氨或加入CaCO3或加入NaOH、KOH的方式進(jìn)行。 全文摘要 本發(fā)明屬于用真菌發(fā)酵生產(chǎn)天然活性脫落酸的新方法。本法通過(guò)改造現(xiàn)有脫落酸菌,改變培養(yǎng)基配方,改液體批次發(fā)酵工藝為連續(xù)流加補(bǔ)料出料以及采取菌種固定化、添加關(guān)鍵底物使產(chǎn)酸量穩(wěn)定,從而大幅度提高產(chǎn)量,降低了能耗和原料的使用量,大幅度降低了生產(chǎn)成本,使工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)成為可能。 文檔編號(hào)C12P7/40GK1182798SQ9611778 公開(kāi)日1998年5月27日 申請(qǐng)日期1996年11月18日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月18日 發(fā)明者譚紅, 李志東, 丁立生, 彭樹(shù)林 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所 |
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