概論+抗原抗體反應(yīng)

1 免疫學(xué)基本概念及其生物學(xué)功能；

免疫：機(jī)體識別和排斥抗原性異物的一種生理功能

免疫三大功能：免疫防御、免疫自穩(wěn)、免疫監(jiān)視

中樞免疫器官（骨髓和胸腺）外周免疫器官（淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體）

免疫細(xì)胞：淋巴細(xì)胞（T，B，NK）、單核巨噬細(xì)胞、其他免疫應(yīng)答細(xì)胞（中性粒、嗜酸性、嗜堿性和肥大細(xì)胞）

免疫分子：免疫球蛋白（IgM，IgG，IgA，IgE，IgD），補(bǔ)體，細(xì)胞因子，細(xì)胞黏附分子，人類白細(xì)胞分化抗原

免疫應(yīng)答：機(jī)體免疫系統(tǒng)接受抗原刺激發(fā)生的一系列反應(yīng)，并以排出或分解該抗原為目的的反應(yīng)過程。過程：抗原的識別、處理、信息傳遞（識別階段），免疫細(xì)胞的激活、增殖、分化（活化階段）以及產(chǎn)生一系列的免疫效應(yīng)因子（效應(yīng)階段）。

臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)：研究免疫學(xué)檢測理論、技術(shù)、應(yīng)用，免疫疾病發(fā)病機(jī)制、免疫診斷、及防治的一門醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用學(xué)科。

免疫學(xué)檢測技術(shù)的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)，免疫學(xué)技術(shù)有凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體參與的反應(yīng)、中和反應(yīng)和標(biāo)記免疫反應(yīng)五種類型。

免疫檢驗(yàn)：1）利用免疫檢測原理和技術(shù)檢測免疫活性細(xì)胞、抗原、抗體、補(bǔ)體、細(xì)胞因子、細(xì)胞黏附分子等免疫相關(guān)物質(zhì)；2）體液中的微量物質(zhì)如激素、酶、血漿微量蛋白、血液藥物濃度、微量元素。

臨床免疫學(xué)：利用免疫學(xué)理論和技術(shù)研究疾病的免疫病理機(jī)制、診斷和鑒別診斷、療效評價(jià)、預(yù)后判斷和預(yù)防的多個(gè)分支學(xué)科的總稱。

免疫性疾?。焊鞣N原因引起的機(jī)體免疫應(yīng)答異常所致的疾病，包括超敏反應(yīng)性疾病、自身免疫病、免疫缺陷病和免疫增生病。

感染免疫學(xué)：研究病原微生物與宿主相互關(guān)系從而控制感染的學(xué)科，傳統(tǒng)免疫學(xué)核心。

腫瘤免疫學(xué)：研究腫瘤免疫原性、機(jī)體抗腫瘤的免疫效應(yīng)及機(jī)體的免疫功能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相互關(guān)系以及腫瘤免疫診斷與防治的學(xué)科。

移植免疫學(xué)：研究移植物與宿主相互關(guān)系從而選擇移植物和延長移植物存活的學(xué)科。

2 血清學(xué)反應(yīng)的概念；

抗體主要存在于血清中，體外的抗原抗體反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)。

抗原抗體反應(yīng)：抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)，特異性取決于抗原表位和抗體超變區(qū)分子間的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性與親和性，并通過靜電引力、范德華引力、氫鍵結(jié)合力和疏水作用力等非共價(jià)鍵結(jié)合在一起。

3 抗原抗體的反應(yīng)原理

Ag決定簇和Ab分子超變區(qū)分子間的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性；分子表面特異的可逆的弱結(jié)合力；親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體

* 親和力（affinity） 是抗體分子上一個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)與對應(yīng)抗原表位之間相互適應(yīng)而存在的引力。這是抗原與抗體之間固有的結(jié)合力。

* 親合力（avidity) 是指反應(yīng)系統(tǒng)中整個(gè)抗原分子與相應(yīng)抗體之間的結(jié)合能力。

親和力與親和性、抗體的結(jié)合價(jià)和抗原的抗原決定簇?cái)?shù)目相關(guān)。親和力越大，抗原抗體結(jié)合越牢固。

K=抗原抗體復(fù)合物濃度/（游離抗原濃度*游離抗體濃度）

K值大的抗體與抗原牢固結(jié)合，不易解離，說明該抗體有高親和力。

親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體：血清學(xué)反應(yīng)條件下，抗原抗體均帶負(fù)電荷，使極化的水分子在其周圍形成水化層，成為親水膠體。

當(dāng)抗原與抗體結(jié)合后，表面電荷減少，水化層變薄，失去親水性能，抗原抗體復(fù)合物成為疏水膠體。 電解質(zhì)作用下，中和膠體表面電荷，使疏水膠體靠攏，形成可見的抗原抗體復(fù)合物。

4 抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)。

特異性：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性。分子基礎(chǔ):抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補(bǔ)性

交叉反應(yīng)：兩種不同的抗原分子具有部分相同或類似結(jié)構(gòu)的抗原表位，可與彼此相應(yīng)的抗血清發(fā)生反應(yīng)

可逆性： 解離后抗原抗體仍保持原有理化性質(zhì)和生物活性。

影響因素：抗體與抗原間的親合力，親合力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離；環(huán)境因素－pH、離子強(qiáng)度

比例性：抗原與抗體發(fā)生可見反應(yīng)需遵循一定的量比關(guān)系。前帶(prezone)：抗體過量。后帶(postzone)：抗原過量。等價(jià)帶(equivalence zone)：抗原抗體比例合適

階段性：親水膠體轉(zhuǎn)疏水膠體的化學(xué)和物理變化過程：抗原抗體特異性結(jié)合（幾秒至幾分鐘，不出現(xiàn)可見反應(yīng)），非特異性促凝集（抗原-抗體復(fù)合物在適合溫度pH電解質(zhì)等環(huán)境因素影響下，進(jìn)一步交聯(lián)和聚集，出現(xiàn)肉眼可見沉淀、凝集、細(xì)胞溶解等反應(yīng)，數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)）

【熟悉免疫學(xué)發(fā)展簡史；抗原及免疫球蛋白的定義及功能

5 抗原抗體的反應(yīng)影響因素。

反應(yīng)物自身因素： *抗原：1.理化特性2.Ag決定簇?cái)?shù)量3.Ag決定簇種類 *抗體：1.來源2.特異性與親和力3.濃度

環(huán)境條件：*電解質(zhì)：0.85%NaCl*使［ Ag-Ab ］表面的電勢下降，失去電荷，破壞水化層，形成凝集或沉淀。濃度過高出現(xiàn)鹽析。

酸堿度：pH6～9*酸凝集：當(dāng)pH為3左右時(shí)，接近細(xì)菌Ag的等電點(diǎn)，可出現(xiàn)非特異性凝集。

蛋白質(zhì)具有兩性電離性質(zhì)，每種都有固定的等電點(diǎn)。反應(yīng)液中pH過高或過低都可影響抗原或抗體的理化性質(zhì)。

溫度：15～40℃，冷凝集為4℃。在一定范圍內(nèi)，溫度增高，分子運(yùn)動(dòng)加快，反應(yīng)速度加快，但結(jié)合不牢固，易解離；溫度低，反應(yīng)速度慢，但結(jié)合牢固。

6 抗原抗體反應(yīng)的類型。

沉淀反應(yīng)；凝集反應(yīng)；補(bǔ)體參與的反應(yīng)；中和反應(yīng)；免疫標(biāo)記

免疫原和抗體的制備（免疫原和抗血清的制備；單克隆抗體與基因工程）

1 免疫原是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體并能與抗體發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)。半抗原是指僅有抗原性而無免疫原性的物質(zhì)，與載體結(jié)合后可具有免疫原性。

2 特異性IgG抗體的純化方法有鹽析法、凝膠過濾法、離子交換層析法、親和層析法等；制備單價(jià)特異性抗血清可采用親和層析法和吸附劑方法。

1 可溶性免疫原制備：粗提——組織勻漿制備，細(xì)胞的破碎

2 可溶性免疫原提純：超速離心法，選擇性沉淀法，凝膠層析法，離子交換層析法，親和層析法，電泳法

1 多克隆抗體的概念

由多種抗原決定簇刺激多株B細(xì)胞增殖分化所產(chǎn)生的抗體，是多種抗體的混合物。

抗血清是經(jīng)過抗原免疫的動(dòng)物血清。在含有多種抗原表位的抗原刺激下，體內(nèi)多個(gè)B細(xì)胞克隆被激活并產(chǎn)生針對多種不同表位的抗體，其混合物為多克隆抗體。

2 多克隆抗體的制備流程；

免疫原(及佐劑)的制備；免疫動(dòng)物（動(dòng)物選擇和動(dòng)物免疫）；試血；采血收集血清；抗血清的鑒定；抗血清的純化；抗血清的保存

3 免疫佐劑的概念、常見種類及作用機(jī)制。

免疫佐劑是先于抗原或與抗原一起注入機(jī)體，可增強(qiáng)機(jī)體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)。

氫氧化鋁，明礬，弗氏佐劑(Freund adjuvant)，脂質(zhì)體，細(xì)胞因子（乳化方式：研磨法：易乳化，但抗原或佐劑用量大。攪拌混合法：無菌操作，節(jié)省抗原或佐劑，但不易乳化完全）

作用機(jī)制：1.改變抗原的物理性狀，使抗原在體內(nèi)滯留或延緩釋放，延長抗原與免疫細(xì)胞作用的時(shí)間，從而增強(qiáng)抗原免疫原性。2.抗原在佐劑的輔助作用下，更易被巨噬細(xì)胞有效吞噬和有效的加工處理和呈遞。3.刺激單核－巨噬細(xì)胞活化，釋放細(xì)胞因子調(diào)節(jié)和增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的應(yīng)答能力。4.刺激淋巴細(xì)胞增生分化，從而增強(qiáng)和擴(kuò)大免疫應(yīng)答能力。

應(yīng)用佐劑的缺點(diǎn)：佐劑常混有微量其它物質(zhì)，這些物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)后也可引起抗體的產(chǎn)主，影響抗血清的特異性；注射佐劑可引起局部形成肉芽腫和無菌性膿腫；反復(fù)注射，易發(fā)生超敏反應(yīng)，使局部組織壞死，甚至引起動(dòng)物死亡。

4 免疫血清制備

動(dòng)物的選擇 1.抗原與免疫動(dòng)物種屬差異越遠(yuǎn)越好； 2.動(dòng)物個(gè)體選擇: 適齡、健壯、無感染正常動(dòng)物、體重合乎要求；3.抗原性質(zhì):酶類—豚鼠；甾體激素—家兔　4.血清用途: R型:等價(jià)帶寬,適于診斷試劑.用家兔免疫產(chǎn)生. H型:等價(jià)帶窄,適于免疫治療.用馬免疫產(chǎn)生.5.抗血清需要量選擇

免疫方法1.免疫劑量：1)不能過大或過小，否則產(chǎn)生免疫耐受；2)首次免疫劑量不宜過大3)大:0.5-1mg/只 小:0.1-0.6mg/只

免疫途徑:1）皮內(nèi)或皮下注射： a.采用多點(diǎn)注射(8-10點(diǎn))；　b.半抗原宜皮內(nèi)多點(diǎn)注射；　c.皮內(nèi)注射易引起細(xì)胞反應(yīng)，對提高抗體效價(jià)有利，但皮內(nèi)注射較困難(因佐劑加入后粘度大)。2）腹腔和靜脈注射:　　多用于顆粒性抗原和加強(qiáng)免疫。3）淋巴結(jié)內(nèi)注射:　　適宜于微量抗原(先用完全佐劑在足掌作基礎(chǔ)免疫)。

免疫時(shí)間：1）間隔約10-20 天（宜長、否則導(dǎo)致免疫耐受）；2）二次以后每次間隔7~10天（過長→刺激變?nèi)酢?抗體效價(jià)不高。）3)一般接種5-8次，不超過2個(gè)月；4)半抗原的免疫間隔要求較長(30~40天)。如 8次免疫后仍不產(chǎn)生抗體，則應(yīng)更換動(dòng)物。

采血及試血頸動(dòng)脈采血法：家兔、綿羊、山羊；心臟采血法： 家兔、豚鼠、大鼠、雞 ；靜脈采血法： 家兔、山羊、綿羊

免疫血清的純化：免疫血清是成分復(fù)雜的混合物，除有特異性和非特異性抗體，還有各種蛋白成分

抗血清——硫酸銨鹽析多次（粗提）——親和層析，離子交換層析，凝膠過濾——IgG類抗體（不純）——親和層析，吸附法——特異性IgG抗體

抗體的鑒定：1.效價(jià)的鑒定：抗體含量測定。 根據(jù)抗原性質(zhì)不同，顆粒性抗原可采用凝集試驗(yàn)?？扇苄钥乖Ｓ妹庖唠p擴(kuò)散法 2 抗體的純度鑒定：SDS-PAGE。若只出現(xiàn)一條蛋白電泳區(qū)帶說明抗體純化已達(dá)到要求，而出現(xiàn)多條蛋白區(qū)帶則表明抗血清中混有雜蛋白，必須進(jìn)一步純化。 3.特異性鑒定：抗體對相應(yīng)或相似抗原識別能力 一般用特異性抗原及其相似的抗原與待鑒定抗體進(jìn)行免疫雙擴(kuò)散試驗(yàn)。如果出現(xiàn)交叉反應(yīng)，說明有雜抗體存在?？蓱?yīng)用相應(yīng)抗原吸收雜抗體，即可得到單價(jià)特異性抗體。4 抗體親和力鑒定：親和力高則靈敏度好:親和力測定主要有平衡透析法、酶聯(lián)免疫法和放射分析法。親和力的高低是由抗原分子和抗體分子的結(jié)合位點(diǎn)、抗原決定簇之間立體構(gòu)型的合適度決定的。

免疫血清的保存：1.4℃保存：可保存3～6個(gè)月 2.低溫保存：-20～-40℃，可保存2～3年?？贵w的保存濃度為20～30mg/ml為宜，加入1/10000的硫柳汞或1/1000的疊氮鈉防腐，并加入等體積的中性甘油，分裝小瓶，置-20℃以下低溫保存。 3.冰凍干燥保存：可保存5～10年

4 單克隆抗體的概念

每一克隆B細(xì)胞所產(chǎn)生的理化性狀高度均一、組成均一、只與同一種抗原決定族反應(yīng)的抗體。

5 淋巴雜交瘤技術(shù)的基本原理

雜交瘤技術(shù)：在細(xì)胞融合技術(shù)的基礎(chǔ)上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細(xì)胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合為B細(xì)胞雜交瘤。

6 單克隆抗體的制備流程

1、親本細(xì)胞的選擇（骨髓瘤細(xì)胞：BALB/C小鼠骨髓瘤NS-1細(xì)胞株和SP2/0細(xì)胞株，致敏B細(xì)胞：免疫脾細(xì)胞，每次抗原用量100μg）2、細(xì)胞融合（細(xì)胞融合劑——PEG種類:分子量1000、1500、4000的PEG是最常用的細(xì)胞融合劑；作用機(jī)理：誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜易打開而有助于細(xì)胞融合；作用特點(diǎn)：隨機(jī)發(fā)生的，不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同。）3、雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)基，篩選與克隆化

3凝集反應(yīng)

1凝集反應(yīng)的原理及特點(diǎn)；

定義：細(xì)菌和紅細(xì)胞等顆粒性抗原或表面包被抗原的顆粒性載體與相應(yīng)抗體結(jié)合后，可出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。

概念：顆粒性抗原 + 相應(yīng)抗體↓(適量電解質(zhì))凝集現(xiàn)象，可溶性抗原（或抗體) + 載體顆?！?致敏顆粒+相應(yīng)抗體（或抗原）↓(適量電解質(zhì))凝集現(xiàn)象

特點(diǎn)：1.抗原為顆粒性抗原或可溶性抗原致敏顆粒；2.反應(yīng)時(shí)間較短，需幾到十幾分鐘；3.反應(yīng)產(chǎn)物為凝集塊；4.凝集反應(yīng)抗原分子大，反應(yīng)面積小，為使抗體分子不致過多，試驗(yàn)時(shí)需稀釋抗體 。

2 常見的直接凝集反應(yīng)；

直接凝集試驗(yàn)：顆粒性抗原在有電解質(zhì)的參與下，直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。

凝集原(agglutinogen)：凝集反應(yīng)中的抗原

凝集素(agglutinin)：凝集參與反應(yīng)的抗體

分類：玻片凝集實(shí)驗(yàn)（將已知抗體與待測顆粒抗原直接低價(jià)在玻片上，混勻并在室溫下反應(yīng)數(shù)分鐘，用肉眼或低倍鏡觀察有無凝集現(xiàn)象，出現(xiàn)顆粒凝集的為陽性反應(yīng)。方法評價(jià)：簡便、快速；定性檢測方法；　　　　　 　但敏感性較低。臨床應(yīng)用：主要用于菌種鑒定和血清學(xué)分型，也可檢測病人血清中有無相應(yīng)的抗體；用于人類ABO血型鑒定。），試管凝集實(shí)驗(yàn)（顆粒性抗原（如細(xì)菌或紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體在試管中直接結(jié)合，在一定條件下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。方法評價(jià)：經(jīng)典的半定量試驗(yàn)；敏感性不高；干擾因素多，影響特異性；操作較簡單。臨床應(yīng)用：用已知抗原測定血清中有無相應(yīng)抗體及其含量，輔助臨床診斷疾病或流行病學(xué)調(diào)查。如外斐試驗(yàn)、肥達(dá)試驗(yàn)、交叉配血試驗(yàn)。）

3 間接凝集反應(yīng)的分類及常見試驗(yàn)。

間接凝集試驗(yàn)：將可溶性抗原(或抗體）吸附或偶聯(lián)于載體上，使之成為致敏載體顆粒，再與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在適宜電解質(zhì)的參與下，出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。

載體(carrier)：試驗(yàn)體系中與免疫無關(guān)的顆粒。

致敏：抗原(或抗體)偶聯(lián)于顆粒表面的過程。

致敏顆粒（sensitized particle): 吸附有已知抗原或抗體的顆粒。

（正向間接凝集反應(yīng)：用抗原致敏載體，檢測標(biāo)本中有無相應(yīng)抗體。先將可溶性抗原結(jié)合與載體顆粒，然后與待測標(biāo)本中的抗體反應(yīng)，出現(xiàn)肉眼可見凝集顆粒或塊。反向簡潔凝集反應(yīng)：用特異性抗體致敏載體，檢測標(biāo)本中有無相應(yīng)抗原。簡潔凝集抑制反應(yīng)：用抗原致敏載體，聯(lián)合相應(yīng)抗體檢測標(biāo)本中是否存在于致敏抗原相同的抗原。

協(xié)同凝集反應(yīng)：金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁中含有A蛋白(staphylococcus protein A,SPA)，SPA具有與IgG的Fc段結(jié)合的特性，利用該特性與IgG抗體相連制成抗體致敏的顆粒載體，當(dāng)它與相應(yīng)抗原反應(yīng)時(shí)出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象即叫協(xié)同凝集試驗(yàn)。

類風(fēng)濕因子檢測： 原理:：類風(fēng)濕因子（ rheumatoid factor RF）是由于細(xì)菌、病毒等感染因子，引起體內(nèi)產(chǎn)生的以變性IgG（一種抗體）為抗原的一種自身抗體。IgM型為主要類型.

IgG吸附于聚苯乙烯膠乳顆粒上作為檢測試劑，在反應(yīng)介質(zhì)中，待檢血清中如含有RF，可與膠乳顆粒出現(xiàn)凝集反應(yīng)。

操作步驟:：在3塊載玻片上分別加一滴RF陽性血清、RF陰性血清及待檢血清；加一滴IgG致敏的膠乳于各血清樣品中，輕微晃動(dòng)載玻片混勻.；1min 后觀察凝集反應(yīng)發(fā)生情況.

注意事項(xiàng):器材要潔凈、血清要新鮮、以確保結(jié)果可靠.；注意陰性、陽性對照的設(shè)立.；注意血清及致敏膠乳加樣量的比例.）

紅細(xì)胞為載體：間接血凝試驗(yàn)（可溶性抗原吸附于人O型紅細(xì)胞或綿羊、家兔紅細(xì)胞上，制備成抗原致敏的紅細(xì)胞，然后與相應(yīng)抗體作用，在有電解質(zhì)存在的條件下，作用一定時(shí)間后可出現(xiàn)肉眼可見的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。方法評價(jià)：敏感性高于直接凝集試驗(yàn)和膠乳凝集試驗(yàn)；操作簡便易行、快速、成本低廉。）

聚苯乙烯膠乳微粒為載體：膠乳凝集試驗(yàn)

間接凝集反應(yīng)特點(diǎn)：敏感、快速、操作簡便、不需特殊儀器；檢測范圍廣(各種抗體和可溶性抗原)。敏感性比直接凝集反應(yīng)高。

間接凝集反應(yīng)應(yīng)用：抗原的檢測：抗體的檢測：感染性疾病、自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病。

4抗球蛋白試驗(yàn)原理及應(yīng)用；

利用抗球蛋白抗體作為第二抗體起橋聯(lián)作用，鏈接與紅細(xì)胞表面抗原結(jié)合的特異抗體，使紅細(xì)胞凝集，用于檢測抗紅細(xì)胞不完全抗體。

直接Coombs試驗(yàn)：新生兒溶血癥，自身免疫性溶血癥，特發(fā)性自身免疫性貧血（患者紅細(xì)胞上不完全抗體）

間接Coombs試驗(yàn)：檢測母體Rh（D）抗體，紅細(xì)胞不相容輸血后產(chǎn)生的血型抗體測定（血清中游離的不完全抗體）

由于不完全抗體只能與一個(gè)RBC的決定簇結(jié)合，而不能同時(shí)與兩個(gè)RBC的決定簇結(jié)合，而抗球蛋白抗體作為第二抗體可達(dá)到連接與RBC表面抗原結(jié)合的特異性抗體，使RBC凝集。

針對于不完全抗體(IgG抗體)的檢測。

4 沉淀反應(yīng)

0 沉淀反應(yīng)

沉淀反應(yīng)是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合而出的沉淀現(xiàn)象.根據(jù)沉淀反應(yīng)介質(zhì)和檢測方法的不同，將其分為液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)、凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)和凝膠免疫電泳試驗(yàn)三大基本類型。

免疫濁法度測定為液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)；單向擴(kuò)散試驗(yàn)平板法是一種定量的凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)，免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物，常見的有對流免疫電泳、火箭免疫電泳、免疫電泳、免疫固定電泳等。

【鉤狀效應(yīng)：由抗原過量引起，導(dǎo)致形成的免疫復(fù)合物分子小，發(fā)生再解離，濁度下降，光散射減少的現(xiàn)象。

【海德堡曲線：抗體過量反應(yīng)體系中，抗體過量時(shí)，免疫復(fù)合物形成隨著抗原遞增至抗原抗體比例最適合處達(dá)到最高峰，沉淀反應(yīng)明顯，而當(dāng)抗原過量時(shí)，形成的免疫復(fù)合物逐漸減少，呈現(xiàn)一個(gè)拋物線形曲線。

1 （凝膠內(nèi)沉淀實(shí)驗(yàn)）單向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)原理和應(yīng)用Mancini曲線和Fahey曲線

原理：將一定量的抗體混于瓊脂凝膠中，使待測抗原溶液在瓊脂內(nèi)由局部向周圍自由擴(kuò)散，在二者濃度比例合適處一定區(qū)域內(nèi)形成可見的白色沉淀環(huán)。環(huán)的大小與抗原濃度成正相關(guān)。

Mancini曲線：大分子抗原（IgM）和長時(shí)間擴(kuò)散（>48）的結(jié)果處理。K=C（抗原濃度）/d的平方（沉淀環(huán)直徑）

Fahey曲線：小分子抗原和擴(kuò)散時(shí)間較短（24h）的結(jié)果處理。K=logC/d

應(yīng)用：原用于定量測定IgG、IgA、IgM、C3、C4、轉(zhuǎn)帖蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等血漿蛋白。

2 雙向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)應(yīng)用

將抗原和抗體溶液分別放在凝膠的對應(yīng)孔中，讓兩者在凝膠中自由擴(kuò)散，當(dāng)抗原與抗體相遇在濃度比例適當(dāng)處形成可見的白色沉淀線。

應(yīng)用：1）血清學(xué)診斷2）免疫化學(xué)分析：沉淀線位置主要與抗原、抗體兩者濃度比例有關(guān)，沉淀線靠近抗原空，提示抗體含量高；靠近抗體空，提示抗原含量多。分子量大擴(kuò)散慢，擴(kuò)散圈小，形成的沉淀線彎向分子量大的一邊。如二者分子量相對，則形成直線。3）抗體效價(jià)滴定：固定抗原濃度，稀釋抗體；或抗原抗體雙方做不同稀釋，經(jīng)自由擴(kuò)散，一出現(xiàn)沉淀線的最高抗體稀釋度為該抗體的效價(jià)。4）分析抗原性質(zhì)5）鑒定抗原或抗體純度：多條沉淀線不純

3 定向免疫擴(kuò)散原理（對流免疫電泳，火箭免疫電泳）

定向免疫擴(kuò)散：在電場作用下，抗原或抗體或二者在凝膠介質(zhì)中定向移動(dòng)發(fā)生的沉淀反應(yīng)。

對流免疫電泳：將雙向免疫擴(kuò)散與電泳結(jié)合在直流電場中的定向加速的免疫擴(kuò)散技術(shù)，常用語抗原或抗體定性分析、效價(jià)測定和純度鑒定。

在pH8.6的巴比妥緩沖液制備瓊脂凝膠板，抗體因等電點(diǎn)高、帶微弱的負(fù)電荷，且分子量較大，因此在電場中的電泳力小于電滲力，泳向負(fù)極；而一般抗原蛋白帶較強(qiáng)的負(fù)電荷，且分子量較小，電泳力大于電滲力，泳向正極。電泳時(shí)，抗原孔放于靠近負(fù)極一側(cè)，抗體孔放于靠近正極的一側(cè)，抗原抗體相對泳動(dòng)，在兩孔間相遇，比例合適時(shí)可形成肉眼可見的沉淀線。

火箭免疫電泳：在抗原電場作用下，在凝膠中定向移動(dòng)、加速發(fā)生的單相免疫擴(kuò)散。用于IgA、IgG、IgM和sIgA，不同成分C3、C4以及裂解產(chǎn)物AFP等血漿蛋白檢測、

在瓊脂糖凝膠板一端打孔、定量加樣后，樣品孔至于電泳槽負(fù)極端。抗原在電場作用下，并與凝膠中的抗體反應(yīng)，逐漸形成梯度濃度，使沉淀帶越來越窄，在抗原、抗體比例適當(dāng)時(shí)形成火箭峰樣沉淀，峰高低與抗原量呈正相關(guān)。

4 定向-自由聯(lián)合免疫擴(kuò)散（免疫電泳原理和應(yīng)用）

免疫電泳：先將蛋白質(zhì)抗原在凝膠中做區(qū)帶電泳，根據(jù)其所帶電荷、分子量和構(gòu)型不同分成不可見的若干區(qū)帶，然后沿電泳方向挖一與之平行的抗體槽，加入相應(yīng)抗血清，進(jìn)行雙向擴(kuò)散，兩者比例適合處形成弧形沉淀線。用于分析純化后的抗原或抗體成分分析，粗略分析其純度；正常及異常體液中免疫球蛋白的識別和鑒定：無丙種球蛋白血癥、冷球蛋白血癥、多發(fā)性骨髓瘤、白血病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肝病等患者的血清蛋白成分的分析；多發(fā)性骨髓瘤血清M蛋白的檢測和鑒定。

免疫固定電泳：在血清蛋白區(qū)帶電泳后，將抗血清或浸透抗血清的乙酸纖維素或?yàn)V紙條放在區(qū)帶表面而不是旁側(cè)槽中，使抗體與對應(yīng)抗原直接發(fā)生沉淀反應(yīng)，使抗原被固定在電泳位置上，對樣品中所含成分及其性質(zhì)進(jìn)行分析鑒定，用于鑒定遷移率相近的蛋白和M蛋白。

5 免疫濁度分析技術(shù)（液相中沉淀反應(yīng)）原理、方法和分類；影響因素（心血管病、血液病、腎功能、神經(jīng)系統(tǒng)。免疫功能。營養(yǎng)狀態(tài)以及藥物濃度的檢測和分析）

原理：可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，兩者比例適合和增濁劑作用下，課快速形成一定大小的免疫復(fù)合物，使反應(yīng)出現(xiàn)濁度。

免疫濁度分析影響因素（抗體的質(zhì)量：特異性高、效價(jià)高、親和力強(qiáng)和使用R型抗體，抗原抗體比例，反應(yīng)的條件：pH6.5~8.5，，離子強(qiáng)度大，增濁劑，標(biāo)本的因素）

透射免疫比濁法：當(dāng)一定波長（340nm）的光線通過抗原抗體反應(yīng)混合液時(shí)，由于抗原-抗體復(fù)合物形成使入射光被反射、吸收或散射而減弱，入社光被吸收的兩與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān)?！井?dāng)抗體量保持過剩時(shí)，怎就抗原量導(dǎo)致免疫復(fù)合物增多、吸光度增強(qiáng)。加入增濁劑聚乙二醇（PEG）8000（消除蛋白質(zhì)分子周圍的電子云和水化層，促進(jìn)特異性抗原、抗體分子靠近并結(jié)合成大分子復(fù)合物 終點(diǎn)法縮短反應(yīng)時(shí)間，速率法 增加反應(yīng)峰值）能加速免疫復(fù)合物形成。

散射免疫比濁法：用激光照射液相中抗原-抗體符合物微粒時(shí)部分光線發(fā)生散射，通過測定免疫復(fù)合物引起的光的散射強(qiáng)度（復(fù)合物大小、形狀和輸了）來測定抗原含量?！井?dāng)抗體保持過剩，反應(yīng)也中加入PEG，增加抗原量會導(dǎo)致散射光快速加強(qiáng)。【終點(diǎn)散射比濁法：當(dāng)抗原抗體相遇后免疫反應(yīng)立即開始，達(dá)到平衡10~30min在復(fù)合物聚合產(chǎn)生絮狀沉淀之前。 速率散射比濁法：單位時(shí)間內(nèi)抗原與抗體反應(yīng)速度或免疫復(fù)合物形成的量；在抗體過量的情況下，隨著抗原量增加，反應(yīng)速度越來越快，棉衣服和物量也迅速增加，出現(xiàn)峰值所需時(shí)間隨之縮短【25S】

6 抗原性質(zhì)分析出現(xiàn)哪三種結(jié)果現(xiàn)象？結(jié)果解釋？

形成的沉淀可出現(xiàn)：相吻、相交、相切三種現(xiàn)象

解釋：互相吻合相連：抗體與兩種抗原中的相同表位結(jié)合形成沉淀，但不能說明兩種抗原完全相同

相交：兩種抗原完全不同

相切：兩種抗原部分相同

5 放射免疫技術(shù)：

【放射免疫技術(shù)：一放射性核素作為示蹤物的一種免疫技術(shù)。

【放射性核素：自然條件下課發(fā)生自發(fā)性轉(zhuǎn)化，由一種核素轉(zhuǎn)變成另一種核素，并同時(shí)放出射線。

【放射性標(biāo)記物：采用氯胺T方法將放射性核素鏈接在抗原或抗體分子上所形成的復(fù)合物

【比放射活性：單位質(zhì)量標(biāo)記物所含的放射性強(qiáng)度，每分子抗原評價(jià)所結(jié)合的放射性園子數(shù)目

【放射化學(xué)純度：在標(biāo)記物中結(jié)合在抗原上的放射活性占該標(biāo)記物總放射活性的百分比

1 放射免疫分析RIA的原理、評價(jià)

原理：標(biāo)記抗原和非標(biāo)記抗原對限量特異性抗體的競爭結(jié)合反應(yīng)。*AgAb信號強(qiáng)度與待測抗原呈反比例關(guān)系。用PEG沉降免疫復(fù)合物，傾倒過剩*Ag，測定沉淀物放射強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

評價(jià)：RIA敏感度高ug/L，與結(jié)構(gòu)類似物質(zhì)見的交叉反應(yīng)少，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，批間批內(nèi)誤差小，標(biāo)本用量少?！痉派湫院怂匾姿プ?，放射性標(biāo)記物不穩(wěn)定，試劑有效期短，核素易對環(huán)境和實(shí)驗(yàn)室造成污染。

2 免疫放射分析IRMA原理、評價(jià)

原理：以過量放射性標(biāo)記抗體與待測抗原進(jìn)行非競爭性免疫結(jié)合反應(yīng)。固相抗原免疫吸附劑（【直接法檢測半抗原。 雙抗體夾心先用固相抗體與抗原反應(yīng)，再與過量的標(biāo)記抗體作用，形成固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物，反應(yīng)平衡后洗滌除去游離的標(biāo)記抗體，測定固相上的放射量【多價(jià)抗原）。Ag-*Ab的放射性強(qiáng)度與待測抗原量呈正比關(guān)系

評價(jià)：敏感性高，兩個(gè)表位不易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，特異性。穩(wěn)定性好，標(biāo)記抗體和固相抗體均屬過量，不易受外界影響，加樣誤差不大。抗體用量偏多，抗體特異性純化較難。

3 相互比較，應(yīng)用

IRMA&RIA被標(biāo)記物：抗體，抗原。標(biāo)記物用量：過量，定量較小。反應(yīng)速率：快，稍慢。反應(yīng)方式：非競爭性結(jié)合，競爭。特異性：高，稍差?？乖瓩z測濃度范圍：寬，較窄。分離技術(shù)：PEG-雙抗體法，固相吸附法。應(yīng)用范圍：小分子半抗原，大分子抗原或抗體。

RIA應(yīng)用：技術(shù)優(yōu)勢（靈敏度高，特異性高，商品化實(shí)際，適合測定小分子半抗原）臨床應(yīng)用（血清激素水平測定；病原體抗原或抗體測定，感染性疾病輔助診斷；血清腫瘤標(biāo)志物測定，腫瘤輔助診斷和評價(jià)療效；藥物測定）

6熒光免疫技術(shù)

1 熒光基本知識，熒光物質(zhì)

【熒光免疫技術(shù)：將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光物質(zhì)檢測的敏感性和直觀性結(jié)合起來的一種免疫分析技術(shù)。

【熒光抗體染色技術(shù)：用熒光抗體對細(xì)胞、組織切片或其他標(biāo)本中的抗原或抗體進(jìn)行鑒定和定位檢測。（熒光免疫顯微技術(shù)：直接法、間接法、補(bǔ)體結(jié)合法和雙標(biāo)記法。）免疫熒光測定術(shù)：時(shí)間分辨熒光免疫測定和熒光偏振免疫測定。

【熒光猝滅：熒光分子在某些理化因素作用下，熒光分子的輻射能力受激發(fā)光較長時(shí)間的照射后會減弱的現(xiàn)象。

【熒光素：能產(chǎn)生明顯熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物

【Stokes位移：選擇熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物時(shí)，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的波長差。

【熒光素影響因素：pH（熒光光譜改變，強(qiáng)度降低）、溫度（20℃以上，熒光溫度猝滅）、熒光素濃度、雜質(zhì)（溶劑中不發(fā)光物質(zhì)：溴化物、碘化物、氨基苯）、細(xì)胞固定劑、化合物（苯胺、酚、硝基苯、鹵化物）

【FITC：異硫氰酸熒光素，黃綠色熒光，易溶于水和乙醇。RB200：四乙基羅丹明，不溶于水，溶于乙醇和丙醛，橘紅色。TRITC四甲基異硫氰酸羅丹明，橙紅色，與FITC配合用于雙標(biāo)記。PE：藻紅蛋白，紅色，流式熒光免疫技術(shù)中PE&FITC共用一個(gè)激發(fā)光。

【鑭系稀土元素Eu3+螯合物激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時(shí)間長，用于時(shí)間分辨熒光免疫測定。

2 熒光標(biāo)記物制備

熒光素標(biāo)記抗體攪拌法：標(biāo)記體積較大、蛋白含量較高的抗體。

熒光素標(biāo)記抗體純化：透析法和凝膠柱層析法去除游離的熒光素，DEAT-纖維素離子交換層析去除未標(biāo)記及過度標(biāo)記的抗體。

鑭系稀土元素標(biāo)記物制備：元素離子不能直接與蛋白質(zhì)結(jié)合，用有雙功能基團(tuán)的螯合劑，將稀土元素與抗體或抗原分子的氨基偶聯(lián)。

常用螯合劑：多羧基類、白塔-二酮體類、BCPDA

標(biāo)記方法：抗體和完全抗原直接標(biāo)記，小分子半抗原先與大分子載體蛋白連接，再標(biāo)記Eu3+

3 熒光免疫顯微技術(shù)原理，評價(jià)，標(biāo)本制作

原理：以熒光顯微鏡為檢測工具，用熒光素標(biāo)記特異性抗體或抗抗體，檢測固定組織細(xì)胞上的抗原或血清中的抗體，常用于定性和定位檢查。

標(biāo)本制作：（組織切片、印片、涂片、單層培養(yǎng)細(xì)胞）（玻片：用無自發(fā)性熒光的優(yōu)質(zhì)玻片，厚度在 0.8至1.2mm；用無水乙醇和乙醚浸泡后使用）固定（作用 ： ①防止標(biāo)本從玻片上脫落； ②除去防礙抗原—抗體結(jié)合的類脂，使抗原抗體結(jié)合物易于獲得良好的染色結(jié)果；③固定的標(biāo)本易于保存，原則：①不能損傷細(xì)胞內(nèi)的抗原；②不能凝集蛋白質(zhì)；③不能損傷細(xì)胞形態(tài)；④固定后應(yīng)保持細(xì)胞膜的通透性，以允許抗體進(jìn)入與抗原結(jié)合。，染色，37℃30min，4℃過夜。

評價(jià)：組織學(xué)中抗原或抗體的定位、定性檢查，高度特異性和形態(tài)直觀。熒光容易消退，難以制備永久性標(biāo)本，非特異熒光干擾。

4 間接免疫熒光法檢測ANA原理和運(yùn)用過程，判斷

用熒光素標(biāo)記抗體與標(biāo)本中相應(yīng)抗原反應(yīng)，再用熒光素標(biāo)記的第二抗體與抗原抗體復(fù)合物中的第一抗體結(jié)合，洗滌干燥后在熒光顯微鏡下觀察特異性熒光，檢測未知抗原或抗體。用于檢測自身抗體，病原體檢測，免疫病理分析。

5 熒光免疫測定技術(shù)（時(shí)間分辨熒光免疫測定）

時(shí)間分辨熒光免疫測定：以鑭系元素標(biāo)記抗體或抗原，并用時(shí)間分辨測定技術(shù)相結(jié)合的新型非放射性微量分析技術(shù)。

鑭系元素?zé)晒鈮勖L，10三次方到六次方倍，用時(shí)間分辨熒光測定儀延緩測量時(shí)間，可排除標(biāo)本中非特異熒光干擾，得到稀土元素螯合物發(fā)射的特異性熒光。光譜激發(fā)光與熒光的波長差別明顯，Eu3+被激發(fā)的熒光光帶窄，發(fā)射峰尖銳，可在極窄的波長范圍內(nèi)測定。（時(shí)間延遲和波長分辨）

7 酶免疫技術(shù)：

1 基本概念

酶免疫技術(shù)：以酶為標(biāo)記物，將酶催化底物的高效性和抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合的免疫技術(shù)。

【一步法優(yōu)缺點(diǎn)：（簡化流程，縮短試驗(yàn)時(shí)間）鉤狀效應(yīng)：標(biāo)本中待測抗原濃度過高，抗原較容易與酶標(biāo)抗體結(jié)合，而未與固相抗體結(jié)合，，不能形成夾心復(fù)合物，最總測定結(jié)果低于實(shí)際含量。假陰性。

2 酶標(biāo)記物制備（供氫體，波長）

HRP：辣根過氧化物酶，由糖蛋白和亞鐵紅素結(jié)合而成。

OPD：鄰苯二胺，黃色，最大吸收波492nm

TMB：四甲基聯(lián)苯胺，酶作用后天藍(lán)色，加酸終止酶變黃色，450nm。

ALP：堿性磷酸酶；白塔-半乳糖苷酶：大腸埃希菌的四聚體蛋白，用于均相酶免疫測定。

3 ELISA酶聯(lián)免疫吸附法原理、評價(jià)（雙抗夾心法：兩步法、一步法優(yōu)缺點(diǎn)；間接法；競爭法；捕獲法）

ELISA：把抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面（免疫吸附），并將抗原或抗體與酶連接形成酶標(biāo)記抗原或抗體（酶聯(lián)），測定時(shí)將待測抗原或抗體和酶（標(biāo)記）抗原或抗體按一定程序與結(jié)合在固相載體上的抗原或抗體反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物，通過洗滌的方法將固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他成分分離，結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量形成一定比例，通過底物顯色的方式定性或定量檢測有色產(chǎn)物量即可確定樣品中待測物質(zhì)的含量。

①雙抗體夾心法：測定大分子抗原，含有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原。先將特異性抗體與固相載體結(jié)合，形成固相抗體；加入待測樣本并溫育，形成固相抗體抗原復(fù)合物，洗滌除去其他游離成分；然后加入酶標(biāo)抗體溫育，形成（固相抗體-待測抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物），洗滌除去游離酶標(biāo)記抗體；加底物，根據(jù)產(chǎn)物顯色程度進(jìn)行抗原的定性或定量檢測。

②間接法：檢測抗體最常用。酶標(biāo)抗體IgG

③競爭法：抗原和半抗原的定量檢測。先用特異性抗體寶寶固相載體，然后同時(shí)加入待測抗原和酶標(biāo)記抗原，待測樣本中的抗原與酶標(biāo)抗原競爭性的與固相載體上的特異性抗體結(jié)合，溫育一定時(shí)間后洗滌，加底物顯色，顯色深淺與標(biāo)本含量呈負(fù)相關(guān)。

④捕獲法：血清中特定抗體Ig類別測定，病原體急性感染診斷中的IgM型抗體檢測。首先將針對IgM的地兒抗體寶寶與固相載體形成固相抗體，加入待測標(biāo)本后，標(biāo)本中所有IgM即可被固相抗體捕獲。第二步加入特異性抗原，其余固相載體上捕獲的IgM特異性抗體結(jié)合，在加入針對特異性抗原的酶標(biāo)記抗體，形成固相抗人μ鏈-IgM-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加入底物顯色。

3 包被概念和方法，封閉；抗體匹配試驗(yàn)

【包被：將抗體或抗原結(jié)合在固相載體上的過程。

【包被方法（加樣，洗板）：用包被緩沖液（pH9.6碳酸鹽，pH7.4磷酸鹽）將欲包被的抗原或抗體稀釋到一定濃度（3~10ug/ml），包被提及為100~150ul/well。包被條件37攝氏度2~6h或4攝氏度過夜。用于包被的蛋白質(zhì)濃度（10ng/ml-20ng/ml）不宜過大，以免形成多層聚集。

【封閉：1~5%牛血清白蛋白或5~20%小牛血清在包被一次反應(yīng)板，高濃度蛋白占據(jù)空白位點(diǎn)（包被液蛋白濃度很低，造成固相載體表面常剩余少量未吸附位點(diǎn)，課非特異地吸附標(biāo)本中的蛋白質(zhì)及酶標(biāo)記物，形成非特異性結(jié)合導(dǎo)致本底偏高）消除干擾。

【抗體匹配試驗(yàn)：雙抗體夾心法測定抗原，當(dāng)使用兩種單克隆抗體作為固相抗體和酶標(biāo)抗體時(shí)，需進(jìn)行抗體匹配試驗(yàn)，一避免空間位阻等其他不利于夾心復(fù)合物形成的影響因素，獲得較好的工作曲線。

4 免疫印跡實(shí)驗(yàn)原理、應(yīng)用

【酶免疫印跡實(shí)驗(yàn)：以膜為固相載體將蛋白質(zhì)抗原直接吸附或通過電轉(zhuǎn)移方式轉(zhuǎn)移至膜載體表面，形成固相抗原，加入特異性抗體和酶標(biāo)記抗抗體，溫育后形成免疫復(fù)合物存在于膜表面，加底物顯色通過膜表面形成有色斑點(diǎn)或條帶判定檢測結(jié)果。（斑點(diǎn)酶免疫實(shí)驗(yàn)，酶免疫滲濾實(shí)驗(yàn)，酶免疫層析實(shí)驗(yàn)，免疫印跡實(shí)驗(yàn)）

【三個(gè)階段：SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)（陰電荷，聚丙烯酰胺凝膠，分子量越小，涌動(dòng)速度越快。分子量大小分成若干區(qū)帶），蛋白區(qū)帶轉(zhuǎn)?。娹D(zhuǎn)移：凝膠-膜夾層組合完全浸入轉(zhuǎn)印緩沖液中，放入鉑絲電極的緩沖液槽；浸有轉(zhuǎn)印緩沖液的吸水紙之間，兩個(gè)石墨平板電極），免疫反應(yīng)與顯色（HRP底物為二氨基聯(lián)苯胺DAB，棕色。不同分子量蛋白參照品，可確定各抗原租房分子量）。

【應(yīng)用：均相酶免疫分析：藥物等小分子物質(zhì)的檢測。ELISA：多種傳染病的實(shí)驗(yàn)室診斷，病毒學(xué)檢測、細(xì)菌學(xué)檢測、免疫球蛋白、不同、腫瘤標(biāo)志物檢測。EIBT：抗原組分及其免疫活性分析，艾滋病，自身抗體譜測定，ENA?！?/p>

5 生物素-親和素系統(tǒng)特點(diǎn)，相關(guān)酶免疫技術(shù)原理

【 BAS特點(diǎn)：特異性高，靈敏度高（親和素同時(shí)與4個(gè)生物素分子結(jié)合，以及生物分子抗原或抗體可結(jié)合多個(gè)生物素分子產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)），穩(wěn)定性強(qiáng)（不可逆反應(yīng)，抗酸堿能力強(qiáng)），實(shí)用性強(qiáng)（可與多種示蹤物質(zhì)如酶、熒光素、鐵蛋白、放射性核素等聯(lián)合用于抗原-抗體、配體-受體、核酸雜交等多種生物學(xué)反應(yīng)體系，也可作為親合介質(zhì)用于上述反應(yīng)物的分離、純化。）。

【BAB法：以標(biāo)記生物素分子為特點(diǎn)，以游離親合素為橋，借助生物素化抗體連接抗原-抗體系統(tǒng)，借助生物素化酶連接信號檢測系統(tǒng)。以游離親和素劇中，分別連接生物素化大分子反應(yīng)體系和標(biāo)記生物素。

【LAB法：以標(biāo)記親和素為特點(diǎn)，將示蹤物質(zhì)（酶，熒光素）標(biāo)記在親和素分子上，借助生物素化抗體再與抗原-抗體系統(tǒng)進(jìn)行偶聯(lián)。

【ABC法：預(yù)先按一定比例將親和素與生物素標(biāo)記示蹤物質(zhì)混合，形成可溶性的親和素-生物素化酶標(biāo)復(fù)合物，同時(shí)確保預(yù)留一定位點(diǎn)再與生物素化的抗體結(jié)合，與抗原-抗體系統(tǒng)進(jìn)行偶聯(lián)。