生物學(xué)家們總是沉迷于對(duì)基因組修修補(bǔ)補(bǔ)，而其中一種近期紅得發(fā)紫的技術(shù)就是 CRISPR。自2012年CRISPR/Cas 首次作為一種基因組編輯工具登臺(tái)以來(lái)，關(guān)于這種技術(shù)的論文數(shù)量就大幅增加，最好的證明之一就是2015年兩位科學(xué)家由于在CRISPR基因組編輯技術(shù)方面的重要貢獻(xiàn)而獲得“科學(xué)突破獎(jiǎng)”，其中一位獲獎(jiǎng)?wù)撸篔ennifer Doudna 最近在范德堡大學(xué)進(jìn)行客座演講，主會(huì)場(chǎng)和分會(huì)場(chǎng)都擠滿了人，從中可以窺見(jiàn)這一技術(shù)的火熱程度。

CRISPR全稱為clustered regularly interspersed short palindromic repeats，是源于細(xì)菌及古細(xì)菌中的一種后天免疫系統(tǒng)，它可利用靶位點(diǎn)特異性的RNA指導(dǎo)Cas蛋白對(duì)靶位點(diǎn)序列進(jìn)行修飾。直到近年，科學(xué)家們才開(kāi)始利用這一系統(tǒng)在活體動(dòng)物基因組中生成靶向突變，刪除原有的基因或插入新基因。

這一技術(shù)發(fā)展迅速，就在去年，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了利用CRISPR/Cas 治愈小鼠中一種罕見(jiàn)肝臟疾病的方法，并且科學(xué)家們也發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)這種方法切除人類免疫細(xì)胞中HIV病毒插入的基因，阻止HIV進(jìn)入血液干細(xì)胞。其原因可能在于這種方法比其它基于核酸酶的編輯方法操作簡(jiǎn)便，研究人員跟著指南操作，進(jìn)行一輪PCR就能基本完成CRISPR實(shí)驗(yàn)了。

但CRISPR/Cas系統(tǒng)也存在自身的一些缺陷，比如進(jìn)入細(xì)胞后，有可能在非目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行酶切，從而導(dǎo)致脫靶，這對(duì)于臨床應(yīng)用來(lái)說(shuō)是一大敗筆。

我們需要更加精確和有效的CRISPR工具，研究人員也正在研究如何避免這類情況的發(fā)生，開(kāi)發(fā)更好的預(yù)測(cè)編輯工具，或者研發(fā)能將CRISPR元件更有效傳遞到細(xì)胞內(nèi)的方式，以下是The Scientist雜志匯總的新進(jìn)展。

癌癥研究的啟示

研究者：康奈爾大學(xué)遺傳學(xué)教授John Schimenti

項(xiàng)目：利用 CRISPR/Cas9 研發(fā)癌癥和減數(shù)分裂小鼠模型

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是通過(guò)在基因組上造成切口來(lái)完成編輯工作，這些切口可以通過(guò)兩種途徑修復(fù)，一種是由非同源性末端接合(Non-homologous end joining， NHEJ) 過(guò)程進(jìn)行粘合，這種方法有效但容易出錯(cuò)；另外一種方法就是加入包含精確目標(biāo)突變的DNA人工片段，利用同源指導(dǎo)修復(fù)（homology-directed repair，HDR，編者譯）完成。

Schimenti 說(shuō)，“問(wèn)題在于這兩個(gè)過(guò)程是競(jìng)爭(zhēng)完成的。前者NHEJ會(huì)由于實(shí)驗(yàn)小鼠出現(xiàn)非目標(biāo)突變受到干擾，”他們希望能找到一種HDR途徑新方法完成有效，且更精確的編輯，

為了解決這一問(wèn)題，研究人員嘗試針對(duì)過(guò)去的果蠅胚胎基因組編輯實(shí)驗(yàn)改進(jìn) HDR/NHEJ 比例，他們通過(guò)遺傳手段抑制了NHEJ途徑中的一個(gè)分子：DNA連接酶IV，碰巧正好有這么一個(gè)小分子抑制劑，SCR7能抑制這種酶的作用（這種小分子在之后的實(shí)驗(yàn)中被證明能作為癌癥治療分子）。

Schimenti研究組在小鼠胚胎中改變了一個(gè)基因的兩個(gè)堿基，結(jié)果證明加入SCR7能將HDR：NHEJ比率從之前的1：10調(diào)整為1：2.5，這一研究成果公布在今年的Genetics雜志上，標(biāo)題為A Mouse Geneticist’s Practical Guide to CRISPR Applications。[文獻(xiàn)]

如何操作：

只要在Cas9 和合成的DNA 被注入到你的單細(xì)胞受精卵之后，在培養(yǎng)基中添加 SCR7就可以了。一些其他的研究組，如范德堡大學(xué)的Douglas Mortlock也在嘗試進(jìn)行這一實(shí)驗(yàn)。Schimenti實(shí)驗(yàn)室常會(huì)在實(shí)驗(yàn)中加入這種物質(zhì)，因?yàn)槟壳翱磥?lái)SCR7并不會(huì)造成什么傷害，不過(guò)“這種小分子確實(shí)會(huì)影響其它基因，所以還是需要進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，”他說(shuō)。

注意事項(xiàng)：

培養(yǎng)基中加入了SCR7（50 μ M）的受精卵生存率更高，但是在two-cell階段，SCR7 會(huì)影響細(xì)胞進(jìn)入囊胚期，其原因尚不清楚。但Schimenti表示這應(yīng)該不成問(wèn)題，因?yàn)樵谀侵熬涂梢詫⑵滢D(zhuǎn)入到雌性小鼠中了。

成本：從Xcessbio公司可以買(mǎi)到SCR7，價(jià)格為129 美元/2 mg（當(dāng)?shù)貎r(jià)格）。

人體細(xì)胞中的可誘導(dǎo)CRISPR

研究者：紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥中心干細(xì)胞生物學(xué)中心的發(fā)育生物學(xué)家Danwei Huangfu

研究項(xiàng)目：利用人類胚胎干細(xì)胞了解胰腺發(fā)育過(guò)程中特殊基因的作用和相互影響 CRISPR/Cas工具的一大挑戰(zhàn)就是將這一系統(tǒng)中的元件傳輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，通常這是通過(guò)電穿孔完成，但是將 CRISPR/Cas系統(tǒng)插入到人類干細(xì)胞中的這一過(guò)程，效率非常低，Huangfu表示，要完成一個(gè)單一突變傳送，需 要一個(gè)月的時(shí)間。

Huangfu的項(xiàng)目要求刪除一個(gè)或多個(gè)基因的兩個(gè)拷貝，這也就意味著多輪靶定，她需要一個(gè)效率更高的系統(tǒng)。

要解決這個(gè)問(wèn)題，最困難的一步是將大體積的Cas9 基因傳入到細(xì)胞內(nèi)，為此Huangfu研究組構(gòu)建了一種已經(jīng)整 合了Cas9元件的細(xì)胞系：首先他們采用了一種相似的技術(shù)TALEN，這種技術(shù)與CRISPR技術(shù)的不同之處在于，前者采用的是DNA結(jié)合位點(diǎn)，后者才有的是導(dǎo)向RNAs（An iCRISPR platform for rapid， multiplexable， and inducible genome editing in human pluripotent stem cells）。[文獻(xiàn)]

“通過(guò)TALENs，我們將 Cas9 整合到了人類干細(xì)胞上的一個(gè)非常特殊的位點(diǎn)，這一位點(diǎn)不易發(fā)生沉默效應(yīng)?！?/p>

研究人員還設(shè)計(jì)了能在藥物多西環(huán)素存在的條件下表達(dá) Cas9 的細(xì)胞。這種方法被稱為iCRISPR，研究人員能 利用iCRISPR在分化過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)里打開(kāi)基因組編輯。（注意不要將iCRISPR與CRISPRi弄混淆了，后者與RNAi相似，能可逆性的阻止轉(zhuǎn)錄）

iCRISPR技術(shù)能將CRISPR/Cas操作主要步驟縮減成一個(gè)：用導(dǎo)向RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，導(dǎo)向RNA要小得多，也更容易進(jìn) 入細(xì)胞。“我們驚訝的發(fā)現(xiàn)（iCRISPR）作用非常好，”Huangfu說(shuō)，利用這一技術(shù)，她的研究組在一個(gè)月的時(shí) 間里完成了12個(gè)基因的突變。

如何操作：

Huangfu研究組公布了這一技術(shù)的詳細(xì)步驟（The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells），如果已經(jīng)有了一些人類干細(xì)胞基因靶向的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，研究人員可以從Addgene 公 司購(gòu)買(mǎi)質(zhì)粒，自己構(gòu)建iCas9 表達(dá)的細(xì)胞。如果材料齊全，那么一到兩個(gè)月時(shí)間就能構(gòu)建出 iCas9 細(xì)胞，再用接下來(lái)的一兩個(gè)月時(shí)間完成基因組編輯細(xì)胞系。 如果不想從頭制作 iCas9 細(xì)胞，那么可以聯(lián)系SKI Stem Cell Research Facility。[文獻(xiàn)]

注意事項(xiàng)：

雖然Huangfu研究組目前還未發(fā)現(xiàn)明顯的脫靶效應(yīng)，但是這一研究組采用了兩種措施來(lái)避免潛在的脫靶（類似 于RNAi實(shí)驗(yàn)）：恢復(fù)實(shí)驗(yàn)（rescue experiments，生物通譯）和用兩個(gè)不同的 CRISPRs 靶向相同基因。

成本：Addgene質(zhì)粒成本為$65（當(dāng)?shù)貎r(jià)格），iCas9 細(xì)胞首次構(gòu)建需要$600，SKI購(gòu)買(mǎi)需要400美元。

新傳送方式

研究者：哈佛大學(xué)化學(xué)與化學(xué)生物學(xué)教授David Liu

項(xiàng)目：在小鼠模型中尋找治療遺傳性耳聾的方法

基因組編輯蛋白需要進(jìn)入靶向細(xì)胞核中完成任務(wù)，但是 CRISPR/Cas9和其它所有大分子一樣，傳遞是一個(gè)主 要問(wèn)題。

而且如果 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是作為DNA質(zhì)粒傳遞進(jìn)入的話，Cas9 核酸酶作用會(huì)增強(qiáng)，不僅會(huì)切斷靶向基因， 而且還會(huì)影響其周?chē)幕颍瑢?dǎo)致脫靶編輯。

為了解決這一問(wèn)題，Liu等人模擬了科學(xué)家們將DNA和RNA一類的核酸傳送至細(xì)胞中去的方式。這一系統(tǒng)依賴于 稱作為陽(yáng)離子脂質(zhì)的正電荷分子，其能夠結(jié)合負(fù)電荷核酸形成脂質(zhì)體。脂質(zhì)體一旦形成，其可通過(guò)至少兩種方 式將內(nèi)容物傳遞到細(xì)胞中。在某些情況下，脂質(zhì)體有可能與細(xì)胞膜融合釋放它的貨物。此外，脂質(zhì)體還可能與 核內(nèi)體膜融合釋放出內(nèi)容物。

“我們有一個(gè)非常簡(jiǎn)單的想法，即將研究人員用來(lái)傳送DNA和RNA的商業(yè)化陽(yáng)離子脂質(zhì)用于傳送蛋白質(zhì)。這次我 們沒(méi)有采用超正電荷蛋白，而是利用了超負(fù)電荷蛋白，其類似于核酸處于高度的負(fù)電荷狀態(tài)。利用陽(yáng)離子脂質(zhì) 來(lái)傳送與高度負(fù)電荷分子結(jié)合的蛋白質(zhì)，相比于采用正電荷蛋白質(zhì)或肽來(lái)傳送蛋白質(zhì)其效力提高了近1000 倍，”Liu說(shuō)。

最終實(shí)驗(yàn)證實(shí)了利用這一新系統(tǒng)來(lái)傳送基因組編輯蛋白質(zhì)，至少與傳送編碼基因組編輯蛋白的DNA所觀察到的 最好結(jié)果一樣高效。而且傳送蛋白比傳送DNA的基因組編輯特異性要高得多。

傳送DNA之后，在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)難以控制編碼蛋白的表達(dá)量。DNA傳送與期望的基因組編輯結(jié)果之間總是無(wú)法一致。在基因組編輯中，其任務(wù)是修復(fù)一個(gè)或兩個(gè)拷貝的基因。而在基因組編輯蛋白完成這一任務(wù)后，你會(huì)想讓它消 失，因?yàn)樵诖酥笏龅木褪遣幌Ｍl(fā)生并有可能是有害的事情。

如何操作：

操作人員可以仔細(xì)閱讀這篇論文的補(bǔ)充信息 (Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo）。Liu表示，“我們盡可能詳細(xì)的描述了 細(xì)節(jié)內(nèi)容，我們希望很多實(shí)驗(yàn)室都能從中獲益?！边@些補(bǔ)充信息也描述了研究組如何調(diào)整多個(gè)變量，優(yōu)化Cas9 傳遞的過(guò)程，對(duì)于有經(jīng)驗(yàn)的分子生物學(xué)家來(lái)說(shuō)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程也相對(duì)簡(jiǎn)單易于理解。[文獻(xiàn)]

注意事項(xiàng)：

研究組還表示這一方法也可以傳送其它大分子，如Cre重組酶和TALENs，Liu實(shí)驗(yàn)室正在嘗試其它的蛋白。

成本：

構(gòu)建自己的 Cas9 蛋白成本約為300 美元（當(dāng)?shù)貎r(jià)格）。而每個(gè)新的導(dǎo)向RNA 成本約 50 美元（包括人力和物力），另外還有轉(zhuǎn)錄和純化試劑盒500 美元（當(dāng)?shù)貎r(jià)格）。

如何消除脫靶效應(yīng)

研究者：佐治亞理工學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程教授Gang Bao

研究項(xiàng)目：基因靶向治療單基因疾病

對(duì)于導(dǎo)向RNA來(lái)說(shuō)，比如20個(gè)堿基的長(zhǎng)度就能很好的與其基因組中靶向序列進(jìn)行匹配，但是這種長(zhǎng)度也能與錯(cuò)配堿基結(jié)合，造成脫靶效應(yīng)。

近期大量基于網(wǎng)站的分析工具都可以用于尋找脫靶序列，但是目前的運(yùn)算法則會(huì)遺漏兩種出現(xiàn)在導(dǎo)向RNA和結(jié)合DNA之間長(zhǎng)度差異以外的非特異性結(jié)合。舉例來(lái)說(shuō)，即使RNA導(dǎo)向配對(duì)序列要比靶向DNA長(zhǎng)一到兩個(gè)堿基，這兩者依然能配對(duì)結(jié)合，但是會(huì)產(chǎn)生一個(gè)“RNA凸起（RNA bulge，編者譯）”。相反，如果DNA序列比導(dǎo)向RNA序列稍微長(zhǎng)一點(diǎn)，就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)“DNA凸起”。

事實(shí)上，去年Bao研究組就發(fā)現(xiàn)凸起變量的脫靶結(jié)合會(huì)導(dǎo)致非目標(biāo)基因組編輯（CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences）?！皩?duì)于所有這些研究，我們都十分擔(dān)心特異性的問(wèn)題，”Bao說(shuō)。[文獻(xiàn)]

為了能找到潛在可能的脫靶效應(yīng)，Bao研究組研發(fā)了一種稱為COSMID的工具，這種工具配合其它CRISPR工具可以幫助研究人員設(shè)計(jì)出一種最小化非特異性Cas9剪切的RNA。如果研究人員已經(jīng)構(gòu)建了導(dǎo)向RNA，那么這種工具還可以幫助他們發(fā)現(xiàn)基因組中潛在的脫靶位點(diǎn)。

如何操作：

在COSMID網(wǎng)站 （crispr.bme.gatech.edu） 上，研究人員可以從列表中挑選目標(biāo)基因組，然后輸入你的導(dǎo)向序列，以及篩選最佳設(shè)計(jì)的相關(guān)參數(shù)?；蛘咭部梢岳靡镌O(shè)計(jì)框來(lái)嚴(yán)重潛在的脫靶位點(diǎn)。

注意事項(xiàng)：

COSMID與其他 CRISPR 設(shè)計(jì)工具一樣， 不僅會(huì)識(shí)別出潛在的脫靶位點(diǎn)，也會(huì)根據(jù)其相關(guān)度進(jìn)行排序?！斑@種排序本身并不是那么精確，”Bao說(shuō)，由于許多其它的因素也會(huì)影響概率分布，因此脫靶序列預(yù)測(cè)需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

同時(shí)范德堡大學(xué)的Mortlock也表示還可以利用這一工具預(yù)測(cè)特異性項(xiàng)目的范圍，比如說(shuō)，如果你想要從一種細(xì)胞系中除去一種蛋白產(chǎn)物，那么就可能無(wú)法太關(guān)注另一個(gè)基因突變，反過(guò)來(lái)也是一樣，如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖悄撤N特殊表型相關(guān)的突變，那么就要檢查一下脫靶的情況。