編者按：20世紀(jì) 70 年代, Pu rves 發(fā)現(xiàn)了甲胎蛋白異質(zhì)體 (AFP varian t)。之后, 由于某些因素的制約, 迄今尚未廣泛應(yīng)用于臨床。 近年來(lái), 許多中外學(xué)者對(duì)AFP 異質(zhì)體進(jìn)行了更為廣泛而深入的研究。 本文作者殷正豐教授在收集、綜合文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上, 對(duì)這一課題的基礎(chǔ)理論和臨床應(yīng)用進(jìn)行了更為深入的研究, 從而論證了AFP 異質(zhì)體可預(yù)警肝癌的發(fā)生, 其作為診斷肝癌標(biāo)志物的主要特點(diǎn)為: 此法不受 AFP>400μg/L作為肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)的限制；不受影像學(xué)檢查結(jié)果為陰性的束縛; 有助于鑒別影像學(xué)檢查難以確診的肝占位性病變; 無(wú)需動(dòng)態(tài)觀察AFP 的含量變化, 從而可縮短肝癌的診斷時(shí)間。 更具實(shí)用價(jià)值的是, 可以借助AFP 異質(zhì)體與AFP 檢測(cè)值的對(duì)比, 判斷患者手術(shù)治療是否徹底, 從而為后續(xù)治療提供重要參考依據(jù)。 本文資料新穎, 行文簡(jiǎn)潔, 方法實(shí)用, 現(xiàn)推廣于此, 以饗讀者。

作者：殷正豐（第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院分子腫瘤實(shí)驗(yàn)室）

關(guān)鍵詞: 肝細(xì)胞瘤; 甲胎蛋白類; 凝集素類; 腫瘤標(biāo)志, 生物學(xué)

甲胎蛋白 (AFP) 是一個(gè)單鏈糖蛋白。 1970 年P(guān)urves 對(duì)肝癌病人血清作凝膠電泳時(shí)最先觀察到AFP有不同的遷移率。隨著生物化學(xué)及其相關(guān)分析技術(shù)的進(jìn)展與應(yīng)用, 發(fā)現(xiàn) AFP分子與外源性凝集素的親和力不同, 即存在不均一性的糖鏈異質(zhì)性。 后來(lái), 通常將氨基酸序列相同, 而糖鏈或蛋白質(zhì)等電點(diǎn)不同的AFP 稱為AFP 異質(zhì)體 (AFP variants)。 通過(guò)大量研究, 證實(shí)AFP分子糖鏈異質(zhì)性與其組織器官來(lái)源有關(guān), 不同生理病理狀況可產(chǎn)生不同的糖鏈結(jié)構(gòu), 并且具有腫瘤特異性。AFP 分子糖鏈結(jié)構(gòu)與惡性腫瘤關(guān)系的確立, 開(kāi)創(chuàng)了根據(jù)蛋白質(zhì)分子糖鏈“質(zhì)”的改變判斷疾病的先河, 在實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)領(lǐng)域突破了腫瘤標(biāo)志物以“量”的異常診斷腫瘤的傳統(tǒng), 有著重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 AFP 異質(zhì)體檢測(cè)方法

自發(fā)現(xiàn)AFP 糖鏈差異以來(lái), 國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者一直致力于建立各種測(cè)定方法, 以期根據(jù)AFP 分子質(zhì)的改變鑒定AFP 的來(lái)源。 通過(guò)制備針對(duì)AFP 不同糖鏈的單克隆抗體, 建立AFP 糖鏈異質(zhì)體直接定量法, 這在理論上似乎是可行的。 然而在實(shí)際工作中,由于糖鏈的抗原性很弱, 難以制備出相應(yīng)的單克隆抗體, 或制備出的單克隆抗體的特異性難以達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。 鑒于凝集素能專一地識(shí)別并結(jié)合某一特定結(jié)構(gòu)的單糖、寡糖或糖鏈中的糖基序列, 目前國(guó)內(nèi)外仍沿用、發(fā)展以凝集素為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法。

1.1　凝集素親和免疫電泳法　將凝集素和瓊脂糖均勻混合后制成凝膠板, 血清點(diǎn)樣后電泳, 與該凝集素結(jié)合的糖蛋白 (包括AFP) 電泳速度降低, 從而與非結(jié)合AFP 分離, 再將凝膠板旋轉(zhuǎn) 90°, 作免疫電泳后借助同位素自顯影, 最后根據(jù)沉淀峰的面積計(jì)算結(jié)合力不同組分的百分比 (凝集素親和免疫電泳自顯影法)。最近, 我們對(duì)這一方法作了改良, 解決了對(duì)單一峰型的結(jié)果難以判斷的問(wèn)題, 使其更為實(shí)用。也可在電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜, 在膜上與AFP 酶標(biāo)抗體結(jié)合, 經(jīng)顯色后測(cè)定各個(gè)分離帶。這種凝集素親和免疫電泳印跡法國(guó)外已有相應(yīng)的商品化試劑盒。 目前國(guó)內(nèi)外在臨床上常采用上述兩種方法, 操作簡(jiǎn)便, 重復(fù)性好。

1.2 AFP 異質(zhì)體比率和 AFP總量同時(shí)自動(dòng)分析法以液相競(jìng)爭(zhēng) (AFP 單克隆抗體與AFP異質(zhì)體結(jié)合受到凝集素的競(jìng)爭(zhēng)抑制) 為基礎(chǔ)并與高壓液相層析相結(jié)合的一種自動(dòng)化免疫測(cè)定系統(tǒng), 可同時(shí)分析AFP異質(zhì)體比率和AFP總量, 批內(nèi)誤差低于6% , 回收率為 92.6%～ 105.6% , 與凝集素親和免疫電泳法具有良好的相關(guān)性。 目前這一分析系統(tǒng)在日本已進(jìn)入臨床應(yīng)用。

2 AFP 異質(zhì)體臨床應(yīng)用

AFP 異質(zhì)體檢測(cè)方法的建立, 進(jìn)一步促進(jìn)了AFP 基礎(chǔ)與臨床研究, 大大擴(kuò)展了AFP 作為腫瘤標(biāo)志物的臨床應(yīng)用潛能?，F(xiàn)已清楚, 不同疾病產(chǎn)生的AFP 在糖鏈結(jié)構(gòu)上各不相同, 應(yīng)用不同的凝集素親和電泳可以把它們分成若干個(gè)組分。 迄今已確定了一些可用于測(cè)定AFP 糖鏈異質(zhì)性的植物凝集素, 如刀豆素A(concanavalin A , Con A )、 E 型紅腰豆凝集(phaseo lu s vulgaris agglutin in, PHA-E)、小扁豆凝集素 (lens culinaris agglutin in, LCA ) 或豌豆凝集素 (pisum sativum agglu tin in, PSA ) 等。由于多種限制, 涉及 Con A、 PHA-E 等凝集素的方法并未能得到臨床應(yīng)用。而診斷意義明確、實(shí)際應(yīng)用價(jià)值大的是 應(yīng)用 LCA 或 PSA 測(cè)定AFP異質(zhì)體。 1981 年Breborow icz 等和 Miyazak 等幾乎同時(shí)報(bào)道了 LCA結(jié)合型AFP 在肝癌診斷中的價(jià)值, 并很快得到大量臨床資料的驗(yàn)證。在最初的試驗(yàn)中,AFP 經(jīng) LCA 電泳分成 2 個(gè)條帶。后來(lái)隨著分離技術(shù)的提高, 卵黃囊腫瘤等病人血清AFP 還可分出位于上述 2 個(gè)條帶之間的另一個(gè)條帶。 根據(jù)3個(gè)條帶電泳遷移率大小依次取名為AFP-L 1、AFP-L 2 和AFP-L 3, 分別代表 LCA 非結(jié)合型、 LCA 弱結(jié)合型和 LCA 結(jié)合型。20 世紀(jì) 80 年代末, 我們發(fā)現(xiàn)PSA在AFP 異質(zhì)體測(cè)定中具有與 LCA 完全相同的應(yīng)用價(jià)值 , 從而以自制的、成本較低的 PSA 取代 LCA , 并作為常規(guī)項(xiàng)目 一直在本院臨床應(yīng)用。 目前認(rèn)為, 通常所說(shuō)的AFP 異質(zhì)體實(shí)際是指與LCA或PSA結(jié)合的AFP-L 3 (下同 ) , 早已列入1999年第四屆全國(guó)肝癌學(xué)術(shù)會(huì)議上通過(guò)的原發(fā)性肝癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)的肝癌標(biāo)記物之一。

2.1 AFP 異質(zhì)體有助于鑒別 AFP 陽(yáng)性良、惡性肝病，無(wú)論采用哪種方法, 國(guó)內(nèi)外研究所得的結(jié)果都一致, 即慢性肝病血清AFP 異質(zhì)體百分比很低, 而原發(fā)性肝癌很高, 表明AFP 異質(zhì)體測(cè)定非常有助于良、惡性肝病的鑒別診斷。 目前大多以 15% 作為區(qū)分良、惡性肝病的閾值。 新近我們對(duì)AFP 低濃度陽(yáng)性良、惡性肝病的研究表明, 肝癌組血清AFP 異質(zhì)體均數(shù)為 (40.5± 31.2) % , 慢性肝炎組為 (6.4±4.9) % , 肝硬化組為 (6.0± 4.5) %。 而慢性肝炎組、肝硬化組及肝癌組> 15% 的陽(yáng)性率分別為 4.2%、5.1% 和 84.6% ,差異有極顯著性 (P <0.01)。 匯總文獻(xiàn)提示，AFP 異質(zhì)體對(duì)肝癌的總敏感性為 50%～60% , 對(duì)大肝癌 (≥ 5 cm ) 的敏感性為 80%～ 90% ,特異性為95%以上, 顯著高于單純AFP定量測(cè)定。應(yīng)用AFP異質(zhì)體鑒別良、惡性肝病應(yīng)注意以下問(wèn)題: (1)AFP 異質(zhì)體上升與血清AFP 值無(wú)關(guān), 只要AFP 陽(yáng)性,AFP 異質(zhì)體就可能升高。我們?cè)谂R床檢測(cè)工作中已發(fā)現(xiàn)很多患者血清AFP 為 20～ 50μg/L , 而AFP 異質(zhì)體呈陽(yáng)性, 從而使肝癌得到及早診斷。因此,AFP 異質(zhì)體非常適用于AFP 低濃度陽(yáng)性良、惡性肝病的鑒別診斷。 (2) 約有 35%～ 45% 小肝癌 (直徑< 2 cm ) 病人已顯示AFP 異質(zhì)體顯著升高。 因此,AFP異質(zhì)體對(duì)肝癌早期診斷很有價(jià)值。(3)AFP 異質(zhì)體的敏感性和特異性均未達(dá)到 100% ,因此存在少數(shù)假陽(yáng)性或假陰性, 尤其是急性肝炎的假陽(yáng)性率較高。 當(dāng)然, 急性肝炎在臨床上較容易排除。 (4)AFP 陰性以及AFP 含量高并已有影像學(xué)檢查結(jié)果支持 (肝癌特征性占位性病變) 的病人不適合作AFP 異質(zhì)體測(cè)定。

2.2 AFP 異質(zhì)體有助于預(yù)警肝癌發(fā)生　 通過(guò)對(duì)慢性肝病患者的前瞻性研究發(fā)現(xiàn), 在影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肝癌特征性占位性病變前數(shù)月乃至數(shù)年,AFP 異質(zhì)體就可能隨肝細(xì)胞癌變而在血中升高。比如, 我們?cè)鴮?duì) 27 例AFP 20～ 400μg/L、影像學(xué)檢查陰性、最后確診為肝癌的病人AFP 異質(zhì)體含量進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察,發(fā)現(xiàn)AFP 異質(zhì)體升高較影像學(xué)檢查陽(yáng)性早出現(xiàn) 3～ 28 個(gè)月 ,AFP 異質(zhì)體陽(yáng)性預(yù)測(cè)肝癌發(fā)生的正確率為 94%。后來(lái) Sato等報(bào)道,AFP 異質(zhì)體升高的肝硬化病人大多數(shù)在 3～ 18 個(gè)月內(nèi)被診斷為肝癌。Shirak i 等對(duì)AFP 異質(zhì)體陽(yáng)性的肝癌病人進(jìn)行回顧分析后也發(fā)現(xiàn), 在影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肝癌特征性占位性病變前 12 個(gè)月就有 41% 的病人AFP 異質(zhì)體升高。可見(jiàn), 在影像學(xué)檢查尚未發(fā)現(xiàn)肝癌特征性占位性病變時(shí), 對(duì)AFP 低濃度陽(yáng)性病例進(jìn)行AFP 異質(zhì)體檢測(cè)可以早期預(yù)警肝癌發(fā)生。

綜上所述,AFP 異質(zhì)體測(cè)定用于肝癌定性診斷具有下述優(yōu)點(diǎn): (1 ) 不受AFP>400μg/L作為肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)的限制；(2) 不為影像學(xué)檢查結(jié)果為陰性的束縛； (3) 有助于鑒別影像學(xué)檢查難以確診的肝占位性病變； (4) 無(wú)需動(dòng)態(tài)觀察AFP含量變化, 從而縮短從AFP含量升高至肝癌確診的時(shí)間。

2.3 AFP異質(zhì)體有助于預(yù)測(cè)肝癌預(yù)后Yamashita等隨訪了55例治療前AFP 異質(zhì)體均為陰性的肝癌病人, 其中32 例(58% )在治療后AFP異質(zhì)體仍陰性, 23例 (42% )則轉(zhuǎn)為陽(yáng)性。 陽(yáng)性組平均生存期顯著低于陰性組, 而且AFP 異質(zhì)體含量與門脈侵犯有關(guān), 陽(yáng)性組多發(fā)性復(fù)發(fā)與門靜脈癌栓形成多于陰性組。如果該指標(biāo)轉(zhuǎn)為陽(yáng)性, 肝內(nèi)遭受侵襲性病變的可能性增加。 另外, Moriwaki 等報(bào)道,經(jīng)根治性外科切除或經(jīng)皮無(wú)水酒精瘤內(nèi)注射的肝癌病人用維 A 酸治療后, 在AFP 異質(zhì)體消失的同時(shí),未見(jiàn)肝癌復(fù)發(fā)。我們?cè)S機(jī)選擇 1991～ 1994 年在本院第一次行肝癌根治性切除術(shù)的AFP 陽(yáng)性肝癌病人作為研究對(duì)象, 通過(guò)隨訪有關(guān)病例, 收集相關(guān)資料, 分析血清AFP 異質(zhì)體含量與肝癌復(fù)發(fā)率、生存率的關(guān)系, 并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明 ,AFP 異質(zhì)體高含量組和低含量組 1、3、5 年累計(jì)復(fù)發(fā)率分別為 32.5% 和 17.4% ; 66.3% 和 45.7% ; 89.2% 和71.7%。高含量組累計(jì)復(fù)發(fā)率明顯增高 (P<0.05)。高含量組和低含量組 1、3、5 年累計(jì)生存率分別為91.2% 和 97.8% ; 63.8% 和 89.1% ; 38.6% 和65.2%。低含量組生存時(shí)間明顯延長(zhǎng) (P < 0.01)。最近 Oka 等分析了388例肝癌病人 (來(lái)自于9家日本醫(yī)院) 的臨床資料, 發(fā)現(xiàn)AFP 異質(zhì)體與肝癌惡性特征有關(guān), 特別是門脈侵犯和腫瘤分化程度, 而且AFP 異質(zhì)體>15% 的相關(guān)性比 > 10% 更確定, 而AFP 濃度與惡性特征則無(wú)關(guān)。新近 Yo sh ida 等也報(bào)道了類似結(jié)果, 認(rèn)為AFP 異質(zhì)體是惡性生物學(xué)的良好指標(biāo), 可作為一個(gè)獨(dú)立的肝癌預(yù)后標(biāo)志物指標(biāo)。

2.4 AFP 異質(zhì)體有助于評(píng)價(jià)肝癌療效本院對(duì)肝癌病人手術(shù)后的隨訪研究表明, 肝癌根治性切除后, 一般在2個(gè)月內(nèi)AFP 轉(zhuǎn)陰,AFP 異質(zhì)體也隨之消失。 如果經(jīng)一段時(shí)間后AFP 雖明顯下降但未轉(zhuǎn)陰, 而AFP 異質(zhì)體變化不明顯, 則提示手術(shù)不徹底,可能還存在切緣殘瘤、血管癌栓、衛(wèi)星結(jié)節(jié)或肝外轉(zhuǎn)移等。 這是因?yàn)橹髁霰磺谐? 產(chǎn)生AFP 的主要細(xì)胞消失,AFP 絕對(duì)值減少,AFP 濃度下降, 但體內(nèi)尚存在來(lái)源于同一克隆的殘瘤, 仍在不斷產(chǎn)生與主瘤產(chǎn)生的AFP 相同的AFP , 因此AFP 異質(zhì)體在AFP總量中的比例無(wú)明顯變化。 另一方面, 如果手術(shù)后AFP 異質(zhì)體隨AFP 含量下降而下降, 一段時(shí)間后AFP 不能轉(zhuǎn)陰, 而AFP 異質(zhì)體下降至診斷值以下,以后兩值相對(duì)恒定, 提示手術(shù)可能較為徹底, 而余肝尚存在肝炎或肝硬化。因?yàn)樵谶@種情形下, 除了肝癌細(xì)胞外, 肝炎或肝硬化亦產(chǎn)生少量糖鏈異質(zhì)性不同的AFP。因此, 當(dāng)腫瘤被切除后,AFP 不能轉(zhuǎn)陰, 但AFP 異質(zhì)體明顯下降。 與上述手術(shù)后AFP 下降但AFP 異質(zhì)體無(wú)明顯下降的病人相比, 這類病人的短期療效可能較好。 后來(lái)Okuda 等也證實(shí)了AFP異質(zhì)體對(duì)評(píng)估肝癌外科療效具有不同于AFP 含量測(cè)定的參考價(jià)值。

3 AFP 異質(zhì)體產(chǎn)生的分子機(jī)制

據(jù)分析, LCA或PSA特異性地識(shí)別、結(jié)合AFP的分子基礎(chǔ)是與肽鏈232位天門冬酰氨相連的 N乙酰葡糖胺上的巖藻糖。 肝癌型AFP之所以與LCA或PSA結(jié)合, 是因?yàn)槠浞肿犹擎溕蠋r藻糖含量較高。 因此在有些文獻(xiàn)中, 用AFP 巖藻糖化指數(shù)取代AFP 異質(zhì)體百分比。 兩者其實(shí)是同一個(gè)概念。至于肝癌型AFP分子糖鏈改變的機(jī)制尚未闡明。與其它糖蛋白一樣,AFP 糖鏈連接與降解過(guò)程是在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)糖基轉(zhuǎn)移酶和 (或) 水解酶協(xié)同作用形成的。而肝癌細(xì)胞發(fā)生某種或某些作用于糖鏈連接與降解的酶代謝障礙, 則可能導(dǎo)致AFP 巖藻糖基化增高。新近Mita 等報(bào)道, 肝癌組織α1-6 巖藻糖轉(zhuǎn)移酶活性增高與肝癌形成巖藻糖基化AFP有關(guān)。而α1-6巖藻糖轉(zhuǎn)移酶參與的催化反應(yīng)是將GDP2巖藻糖上的巖藻糖轉(zhuǎn)移至糖蛋白 (如AFP )N-寡糖 N-乙酰氨基葡萄糖殘基的還原末斷 (通過(guò)α1-6 連接)。

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