根據(jù)自己的實驗體會，總結(jié)做好 WB 的一些心得，希望對你實驗有幫助。圍繞著實驗的每個步驟展開敘述，這樣可能更具體更好理解。

該部分較為重要的是配制凝膠時要充分混勻，此外應(yīng)保證試劑的新鮮。常出現(xiàn)的問題有：A. 凝膠出現(xiàn)花紋：此時應(yīng)檢查原料中過硫酸銨（AP）粉末是否受潮。B. 凝膠聚合時間較長：聚合時間由 AP 以及 TEMED 決定，通常在 30 min 左右，AP 不新鮮會導(dǎo)致聚合變慢。此外還需注意環(huán)境的溫度也很重要，氣溫較低時膠是會凝得慢一些，必要時可適當增加 AP 以及 TEMED 的量，但通常不會超過 1 h，若超過 1 h 甚至更長仍未聚合，應(yīng)檢查配制的操作有無錯誤。

該部分蛋白樣品本身很關(guān)鍵，若蛋白提取過程存在問題或蛋白發(fā)生降解則很難進行好之后的實驗，也就很難做出好的結(jié)果了。除此之外 loading buffer 的作用也不容忽視，切莫使用不新鮮的上樣緩沖液，同時在處理時將樣品與 loading buffer 混合均勻也應(yīng)注意。

首先在跑積層膠時應(yīng)盡可能使樣品壓齊，若上樣量較大（如細胞蛋白通常上樣在 20-30 甚至 40 ul），可適當減小電壓跑 20-30 min，待壓齊后方可開始分離。

該環(huán)節(jié)電流的大小，轉(zhuǎn)膜的時間決定是否能成功將蛋白轉(zhuǎn)上，而具體的參數(shù)應(yīng)取決于所要蛋白的分子量大小，應(yīng)反復(fù)摸索，本人在實驗中得出的經(jīng)驗為：10 KDa：200 mA 1 h，60 KDa 70 V，2 h，90 KDa 70 V，4 h，200 KDa 70 V，6 h。

此外還有如下幾個細節(jié)問題需要注意：

膜的選擇：PVDF 還是 NC，0.22 μm 還是 0.45 μm。

轉(zhuǎn)膜液中甲醇的量：通常在 10%-20%，蛋白分子量較大時可適當減少，蛋白分子量小時應(yīng)適當增加，建議先從 15% 開始。

該步驟一般不易出現(xiàn)問題，常見的有室溫 2-3 h，或者 4 度封閉過夜，但仍需強調(diào)一點的是有些抗體的使用需配套使用特殊的封閉液。

通常購買到一種新抗體后，還是建議先按說明書推薦的濃度比例在室溫孵育 2-3 h。若該抗體效價較好，應(yīng)該顯帶很漂亮，尤其是在抗體剛買時間不長，然而事情往往不能盡如人意。我們在遇到一個不好的抗體時該怎么辦？可通過延長孵育時間（如：4 度過夜孵育甚至室溫過夜孵育），增大抗體濃度。如果你想盡了一切可能結(jié)果仍然很不理想，建議還是換抗體吧，不要再浪費時間與精力了。

個人認為洗膜液洗 3 遍，每遍 10 min 足以。沒有必要過多次數(shù)過長時間，膜的背景不好很多時候并不是沒洗干凈，更多的應(yīng)該去考慮抗體濃度是否過高等其他原因。本人實驗過程中曾經(jīng)做過兩個抗體，其他的條件一樣（甚至是從一張膜上剪開的），背景卻相差很大，你能說是沒洗干凈嗎？洗二抗同樣如此。

選擇好一個合適的條件不要輕易改變，另外相比一抗，二抗作用的時間應(yīng)嚴格控制，實踐證明一抗時間長點可能沒什么關(guān)系，而二抗時間若過長過短都將會直接影響結(jié)果。

本文作者系丁香園中級站友：hangpengzhou

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