作者: holyala (站內(nèi)聯(lián)系TA)    發(fā)布: 2011-04-18

今天看到一個(gè)帖子討論第二代測(cè)序，可惜回帖寥寥。在基因組學(xué)研究如火如荼的年代，就算不做測(cè)序，了解一下這項(xiàng)技術(shù)也是不錯(cuò)的。竊以為在不遠(yuǎn)的將來(lái)，個(gè)人基因組應(yīng)用必將廣泛開(kāi)展，而第二代或第三代測(cè)序技術(shù)正是這一領(lǐng)域的主角。不才在這一領(lǐng)域也混了小兩年，多少有些了解，今天特發(fā)此專題，希望能給大家?guī)?lái)一點(diǎn)有意思的東西。
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第二代測(cè)序技術(shù)（Next-Generation Sequencing）
NGS之基礎(chǔ)篇
    2001年，美、英、法、德、日、中六國(guó)合作，歷時(shí)十年，耗資數(shù)十億美元的人類基因組計(jì)劃（Human Genome Project，HGP）宣告完成。轉(zhuǎn)眼又是十年過(guò)去，在此期間，各國(guó)科學(xué)家仍在為解讀基因的密碼而不懈努力，這其中最大的突破，就是第二代測(cè)序技術(shù)的推出。HGP的順利完成證明了我們有能力對(duì)自身的遺傳信息進(jìn)行研究，然而，高昂的成本、漫長(zhǎng)的時(shí)間、巨大的人力需求，無(wú)不限制著對(duì)遺傳密碼的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。從HGP開(kāi)始的第一天期，科學(xué)家們就在尋求更好的方法來(lái)對(duì)基因組進(jìn)行研究，“鳥(niǎo)槍法”就是其中之一。2006年，美國(guó)X大獎(jiǎng)基金會(huì)（www.xprize.org）設(shè)立了獎(jiǎng)金高達(dá)1000萬(wàn)美元的基因組Archon X大獎(jiǎng)，旨在獎(jiǎng)勵(lì)第一個(gè)在10天內(nèi)以低于100萬(wàn)美元的成本完成100個(gè)人類基因組測(cè)序的民間團(tuán)隊(duì)。而羅氏（Roche）、應(yīng)用生物系統(tǒng)（Applied Biosystems，ABI）、Illumina三家公司先后推出了各自的第二代高通量測(cè)序平臺(tái)，成為NGS領(lǐng)域的領(lǐng)頭羊。
    2005年底，454公司推出第一個(gè)基于焦磷酸測(cè)序原理的高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)——Genome Sequencer 20 System，這是核酸測(cè)序技術(shù)發(fā)展史上里程碑式的事件。隨后，羅氏公司以1.55億美元收購(gòu)了454公司，并在2006年推出了更新的GS FLX測(cè)序系統(tǒng)，該系統(tǒng)可在10小時(shí)的運(yùn)行中獲得100萬(wàn)條讀長(zhǎng)（reads），4~6億個(gè)堿基信息（base pair），且準(zhǔn)確率達(dá)到99%以上。2008年，GS FLX系統(tǒng)再次升級(jí)，通量提高了5倍，讀長(zhǎng)和準(zhǔn)確率也有所增加。雖然454 GS測(cè)序平臺(tái)也許不是市場(chǎng)占有率最高的測(cè)序儀，但截至2011年3月，利用該系統(tǒng)進(jìn)行研究的論文已發(fā)表超過(guò)1000余篇，而它在讀長(zhǎng)上的優(yōu)勢(shì)明顯勝于另兩套系統(tǒng)，因此在從頭測(cè)序（de novo）和宏基因組測(cè)序（meta genome）方面有著不可替代的地位。
    2006年，Solexa公司也推出了自己的NGS系統(tǒng)——Genome Analyzer，簡(jiǎn)稱GA。這套基于DNA簇（DNA cluster）、橋式PCR（Bridge PCR）和可逆阻斷（Reversible terminator）等核心技術(shù)的系統(tǒng)具有高通量、低錯(cuò)誤率、低成本、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。2007年，Illumina公司以6億美元的高價(jià)收購(gòu)了Solexa，使GA得以商品化。GA最早期的版本一次運(yùn)行可獲得1Gb的數(shù)據(jù)，因此也有1Gb Analyzer的含義，而最新的Hiseq2000平臺(tái)則能夠在10天的運(yùn)行中獲得300Gb以上的數(shù)據(jù)，讀取的堿基長(zhǎng)度達(dá)到150bp左右。更有消息稱，Illumina已完成了600Gb的運(yùn)行測(cè)試并在部分客戶中開(kāi)展了前期體驗(yàn)，Tb（1000Gb）級(jí)的測(cè)試Run也將于年內(nèi)進(jìn)行。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，Illumina公司已售出超過(guò)600臺(tái)/套GA IIx和Hiseq2000平臺(tái)，2010年僅深圳華大基因研究院一家就購(gòu)買(mǎi)了128臺(tái)Hiseq2000，一舉成為全球最大的基因組測(cè)序與分析中心，Illumina公司在測(cè)序領(lǐng)域的影響力由此可見(jiàn)一斑。
    在Sanger測(cè)序時(shí)代，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI）一直是該行業(yè)的龍頭老大，其壟斷地位無(wú)人能撼，從早期的377到全自動(dòng)化的3730xl，ABI的測(cè)序儀被廣泛應(yīng)用在基因組學(xué)研究的各個(gè)方面。然而在第二代測(cè)序技術(shù)迅猛發(fā)展之初，ABI起步較晚，顯得有些漫不經(jīng)心。直到2005年454公司推出GS平臺(tái)，ABI的領(lǐng)先地位受到威脅，這才開(kāi)始發(fā)力，迅速收購(gòu)了研發(fā)NGS的一家小公司Agencourt，并于2007年推出了它的SOLiD測(cè)序平臺(tái)。此后SOLiD不斷升級(jí)，目前已到SOLiD 5版本（SOLiD 5500xl）。SOLiD的全稱是Sequencing by Oligo Ligation Detection，即寡聚物連接檢測(cè)測(cè)序，其基本原理是通過(guò)熒光標(biāo)記的8堿基單鏈DNA探針與模板配對(duì)連接，發(fā)出不同的熒光信號(hào)，從而讀取目標(biāo)序列的堿基排列順序。在該方法下，目標(biāo)序列的所有堿基都被讀取了兩遍，因此SOLiD最大的優(yōu)勢(shì)就是它的高準(zhǔn)確率。據(jù)悉，SOLiD 5平臺(tái)的測(cè)序通量已達(dá)到30Gb/天，成本低于60美元/Gb，準(zhǔn)確率高達(dá)99.99%。并且由于SOLiD系統(tǒng)采用的不是PCR反應(yīng)進(jìn)行DNA合成與測(cè)序，因此對(duì)于高GC含量的樣本，SOLiD系統(tǒng)具有非常大的優(yōu)勢(shì)。
宣傳視頻：
454
沒(méi)找到
Solexa
http://www./Media/flash_player.ilmn?dirname=systems&swfname=GA_workflow_vid&width=780&height=485&iframe
SOLiD
http://media.invitrogen.com./ab/applications-technologies/solid/solid-5500.html
今天繼續(xù)，454測(cè)序詳解。
NGS之進(jìn)階篇
    454的焦磷酸測(cè)序原理，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是利用DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用，將PCR反應(yīng)每一個(gè)堿基（dNTP）的延伸與一次熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)記錄熒光信號(hào)的有無(wú)和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。在454測(cè)序儀中，A、T、G、C四種堿基是分別存儲(chǔ)在單獨(dú)的試劑瓶中的，每步反應(yīng)四種堿基依次加入反應(yīng)池，當(dāng)堿基配對(duì)結(jié)合，就會(huì)釋放出一個(gè)焦磷酸（PPi），而這個(gè)焦磷酸在酶的作用下，將熒光素氧化成氧化熒光素，并發(fā)出光信號(hào)，從而讀取出這一位置的堿基信息。
    454測(cè)序儀的整個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟可大致概括為：樣品處理、文庫(kù)制備、emPCR、反應(yīng)板準(zhǔn)備、上機(jī)測(cè)序。樣品處理主要是針對(duì)大片段的DNA分子，如基因組DNA、Fosmid或BAC質(zhì)粒等，利用超聲或氮?dú)獯驍鄬⑦@些DNA分子片段化，然后采用瓊脂糖凝膠電泳回收或磁珠純化，選擇500-800bp的DNA片段。對(duì)于非編碼RNA或PCR產(chǎn)物，則不需要這一步驟。文庫(kù)制備包括接頭連接和磁珠純化兩步，454的文庫(kù)接頭分A、B兩種，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的測(cè)序引物及4bp（TCAG）的“key”堿基構(gòu)成，其中B接頭的5’端帶有生物素（Biotin）標(biāo)記，用于磁珠純化步驟。經(jīng)過(guò)磁珠結(jié)合與DNA變性之后，只有A+目的片段+B形式的連接產(chǎn)物得以富集，另兩種形式（AA、BB）的產(chǎn)物都被去除。emPCR是454測(cè)序的一個(gè)關(guān)鍵步驟，將富集到的文庫(kù)與測(cè)序磁珠、各反應(yīng)物混合，加入特定的礦物油和表面活性劑，再利用振蕩器劇烈振蕩，使反應(yīng)體系形成油包水（water-in-oil）的穩(wěn)定乳濁液。在理想條件下，每一個(gè)液滴，或稱微反應(yīng)器（microreactor）中將只包含一個(gè)磁珠和一條單鏈DNA，通過(guò)控制該步驟的條件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方個(gè)理想的微反應(yīng)器。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，每一個(gè)磁珠上將形成密集的DNA簇，這些DNA序列完全相同，即可用于后續(xù)的步驟。454測(cè)序的反應(yīng)板稱為PTP（Pico Titer Plate），含有350萬(wàn)個(gè)由光纖組成的小孔，每個(gè)孔的直徑為29μm，而測(cè)序磁珠的直徑為20μm，因此每個(gè)孔中僅能容納一個(gè)磁珠。將磁珠與測(cè)序試劑加入PTP中，使之可用于上機(jī)測(cè)序。測(cè)序步驟如前所述，四種堿基在泵的控制下依次加入反應(yīng)板，反應(yīng)完成后再洗去，每延伸一個(gè)或若干個(gè)堿基，就會(huì)發(fā)出一次光信號(hào)，通過(guò)記錄信號(hào)的有無(wú)和強(qiáng)度，即可測(cè)定DNA序列。
    454測(cè)序準(zhǔn)確度較高，當(dāng)讀長(zhǎng)超過(guò)400bp時(shí)，其準(zhǔn)確性仍能達(dá)到99%以上，主要的錯(cuò)誤來(lái)自于同聚物，即相同堿基的連續(xù)延伸，如ATTTG這樣一段序列，A和G的讀取沒(méi)有問(wèn)題，但T只記錄了一次光信號(hào)，僅信號(hào)強(qiáng)度與ATG序列的T有所不同，因此同聚物越長(zhǎng)，可能產(chǎn)生的誤差就越大。目前，由于454測(cè)序儀在讀長(zhǎng)上的明顯優(yōu)勢(shì)，它在大基因組從頭測(cè)序（de novo）、轉(zhuǎn)錄組分析、基因組結(jié)構(gòu)分析等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。
   
    以下圖片：1. 454 GS FLX測(cè)序儀外觀；2. 3（4）種連接產(chǎn)物的磁珠純化；3. PTP板與測(cè)序磁珠；4. 454 GS測(cè)序峰圖；5. 上機(jī)準(zhǔn)備實(shí)拍圖。

NGS之進(jìn)階篇二：Solexa
    Illumina Solexa高通量測(cè)序平臺(tái)可以說(shuō)是目前“測(cè)序界”應(yīng)用最廣泛的NGS平臺(tái)，它在兼容性、操作性和成本方面有著較大的優(yōu)勢(shì)，第一個(gè)亞洲人基因組“炎黃一號(hào)”、第一個(gè)非洲人基因組、熊貓基因組、家蠶基因組甲基化圖譜等等，都是在該平臺(tái)的支持下完成的。從最初的GA到GA IIx，又更新?lián)Q代為現(xiàn)在的Hiseq2000，Solexa測(cè)序平臺(tái)的通量由1Gb/run一路提升至300Gb/run，預(yù)計(jì)在年內(nèi)還將實(shí)現(xiàn)1Tb/run的升級(jí)，測(cè)序讀長(zhǎng)也從幾十bp提高到150bp。當(dāng)年的人類基因組計(jì)劃用了10年時(shí)間完成了一個(gè)基因組的精細(xì)圖，而現(xiàn)在使用Hiseq2000測(cè)序儀只需10天左右的時(shí)間，即可完成至少3個(gè)人類全基因組的測(cè)序工作，NGS測(cè)序能力的飛速發(fā)展甚至超過(guò)了IT屆的摩爾定律。
    與454一樣，Solexa測(cè)序平臺(tái)所采用的也是SBS（Sequencing-by-Synthesis，邊合成邊測(cè)序）的方式，并且也利用光信號(hào)收集信息。有所不同的是，Solexa并沒(méi)有采用間接反應(yīng)（焦磷酸氧化熒光素）的形式激發(fā)光信號(hào)，而是直接在dNTP上連接熒光基團(tuán)和阻斷基團(tuán)，通過(guò)“去阻斷—延伸—激發(fā)熒光—切割熒光基團(tuán)—去阻斷”這樣一個(gè)循環(huán)的方法來(lái)依次讀取目的DNA上的堿基排列順序。如下圖所示，該原理在基礎(chǔ)篇的Solexa宣傳視頻中亦有提及。由于采用了可逆阻斷技術(shù)（即在dNTP上連接可剪切的阻斷基團(tuán)），Solexa測(cè)序的每一步只延伸一個(gè)堿基，不會(huì)出現(xiàn)類似于454測(cè)序的同聚物影響準(zhǔn)確性的問(wèn)題，因此其單堿基準(zhǔn)確性較高，但隨著讀長(zhǎng)的增加，熒光信號(hào)會(huì)有所衰弱，所以越“靠后”的堿基準(zhǔn)確性會(huì)逐漸降低，這也是Solexa測(cè)序讀長(zhǎng)受限的一個(gè)主要因素。

    Solexa平臺(tái)的應(yīng)用范圍極廣，幾乎囊括了目前基因組學(xué)研究的所有方面，例如基因組從頭測(cè)序（de novo）、重測(cè)序（re-sequencing）、基因組結(jié)構(gòu)分析、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、表達(dá)譜分析、小RNA及非編碼RNA測(cè)序、表觀遺傳學(xué)研究等等。然而，應(yīng)用該平臺(tái)的核心過(guò)程是大致相同的，這也為它的兼容性提供了很大的便利。Solexa測(cè)序的實(shí)驗(yàn)流程主要包括：樣品處理、文庫(kù)制備、芯片準(zhǔn)備及上級(jí)測(cè)序。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜆悠穪?lái)源的不同，Solexa測(cè)序的樣品處理也有所不同，基因組DNA需進(jìn)行打斷及片段選擇，total RNA需富集mRNA或小RNA，mRNA也要進(jìn)行片段化處理，ChIP（染色質(zhì)免疫共沉淀）、甲基化及PCR產(chǎn)物等都有各自的處理方式，需要實(shí)驗(yàn)人員根據(jù)情況進(jìn)行選擇。以基因組DNA測(cè)序?yàn)槔?，在獲得樣本后，首先需要對(duì)DNA進(jìn)行檢測(cè)，保證樣本的濃度和完整性符合實(shí)驗(yàn)要求，然后使用超聲或氮?dú)獯驍?，將這些DNA分子片段化，這步與454的樣品處理類似，但不需要收集特定范圍的DNA片段即可用于下一步實(shí)驗(yàn)。文庫(kù)制備過(guò)程可分為末端修復(fù)、3’端腺苷化、接頭連接、片段選擇、PCR擴(kuò)增以及文庫(kù)純化六個(gè)步驟。末端修復(fù)是將片段化的DNA分子在幾種酶的作用下，補(bǔ)齊隨機(jī)打斷造成的黏性末端而成為平末端。3’腺苷化目的是在DNA雙鏈的3’端加上dATP，以便于下一步的接頭連接。Solexa文庫(kù)制備所用的接頭（adapter）是一個(gè)一端互補(bǔ)，另一端開(kāi)叉Y字形DNA片段，互補(bǔ)的部分5’端有一個(gè)T，可與3’腺苷化的DNA進(jìn)行T-A連接，開(kāi)叉的部分則是為了通過(guò)PCR擴(kuò)增引入測(cè)序引物P5和P7的互補(bǔ)序列。接頭連接完成后，再采用采用瓊脂糖凝膠電泳回收或磁珠純化獲得特定大小的片段（通常為目的片段大小+120bp），如構(gòu)建200bp文庫(kù)，則回收320±20bp的DNA。之后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增和純化，即得到可用與上機(jī)測(cè)序的文庫(kù)。此時(shí)的文庫(kù)DNA由待測(cè)序列、測(cè)序接頭、引物互補(bǔ)序列及index標(biāo)簽序列（如非index文庫(kù)則無(wú)），如下圖所示。

    芯片準(zhǔn)備與上機(jī)測(cè)序主要由機(jī)器完成，在此不做贅述，若想做進(jìn)一步了解，可訪問(wèn)Illumina官方網(wǎng)站的技術(shù)支持：http://www./technology/sequencing_technology.ilmn。
    同樣，最后獻(xiàn)上幾張圖片：1. cBot芯片制備儀與Hiseq2000測(cè)序儀；2. Solexa GAII測(cè)序芯片；3. Solexa測(cè)序光信號(hào)采集直觀圖；4. Solexa測(cè)序流程與原理示意圖。

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第二代測(cè)序技術(shù)（Next-Generation Sequencing）
NGS之基礎(chǔ)篇
    2001年，美、英、法、德、日、中六國(guó)合作，歷時(shí)十年，耗資數(shù)十億美元的人類基因組計(jì)劃（Human Genome Project，HGP）宣告完成。轉(zhuǎn)眼又是十年過(guò)去，在此期間，各國(guó)科學(xué)家仍在為解讀基因的密碼而不懈努力，這其中最大的突破，就是第二代測(cè)序技術(shù)的推出。HGP的順利完成證明了我們有能力對(duì)自身的遺傳信息進(jìn)行研究，然而，高昂的成本、漫長(zhǎng)的時(shí)間、巨大的人力需求，無(wú)不限制著對(duì)遺傳密碼的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。從HGP開(kāi)始的第一天期，科學(xué)家們就在尋求更好的方法來(lái)對(duì)基因組進(jìn)行研究，“鳥(niǎo)槍法”就是其中之一。2006年，美國(guó)X大獎(jiǎng)基金會(huì)（www.xprize.org）設(shè)立了獎(jiǎng)金高達(dá)1000萬(wàn)美元的基因組Archon X大獎(jiǎng)，旨在獎(jiǎng)勵(lì)第一個(gè)在10天內(nèi)以低于100萬(wàn)美元的成本完成100個(gè)人類基因組測(cè)序的民間團(tuán)隊(duì)。而羅氏（Roche）、應(yīng)用生物系統(tǒng)（Applied Biosystems，ABI）、Illumina三家公司先后推出了各自的第二代高通量測(cè)序平臺(tái)，成為NGS領(lǐng)域的領(lǐng)頭羊。
    2005年底，454公司推出第一個(gè)基于焦磷酸測(cè)序原理的高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)——Genome Sequencer 20 System，這是核酸測(cè)序技術(shù)發(fā)展史上里程碑式的事件。隨后，羅氏公司以1.55億美元收購(gòu)了454公司，并在2006年推出了更新的GS FLX測(cè)序系統(tǒng)，該系統(tǒng)可在10小時(shí)的運(yùn)行中獲得100萬(wàn)條讀長(zhǎng)（reads），4~6億個(gè)堿基信息（base pair），且準(zhǔn)確率達(dá)到99%以上。2008年，GS FLX系統(tǒng)再次升級(jí)，通量提高了5倍，讀長(zhǎng)和準(zhǔn)確率也有所增加。雖然454 GS測(cè)序平臺(tái)也許不是市場(chǎng)占有率最高的測(cè)序儀，但截至2011年3月，利用該系統(tǒng)進(jìn)行研究的論文已發(fā)表超過(guò)1000余篇，而它在讀長(zhǎng)上的優(yōu)勢(shì)明顯勝于另兩套系統(tǒng)，因此在從頭測(cè)序（de novo）和宏基因組測(cè)序（meta genome）方面有著不可替代的地位。
    2006年，Solexa公司也推出了自己的NGS系統(tǒng)——Genome Analyzer，簡(jiǎn)稱GA。這套基于DNA簇（DNA cluster）、橋式PCR（Bridge PCR）和可逆阻斷（Reversible terminator）等核心技術(shù)的系統(tǒng)具有高通量、低錯(cuò)誤率、低成本、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。2007年，Illumina公司以6億美元的高價(jià)收購(gòu)了Solexa，使GA得以商品化。GA最早期的版本一次運(yùn)行可獲得1Gb的數(shù)據(jù)，因此也有1Gb Analyzer的含義，而最新的Hiseq2000平臺(tái)則能夠在10天的運(yùn)行中獲得300Gb以上的數(shù)據(jù)，讀取的堿基長(zhǎng)度達(dá)到150bp左右。更有消息稱，Illumina已完成了600Gb的運(yùn)行測(cè)試并在部分客戶中開(kāi)展了前期體驗(yàn)，Tb（1000Gb）級(jí)的測(cè)試Run也將于年內(nèi)進(jìn)行。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，Illumina公司已售出超過(guò)600臺(tái)/套GA IIx和Hiseq2000平臺(tái)，2010年僅深圳華大基因研究院一家就購(gòu)買(mǎi)了128臺(tái)Hiseq2000，一舉成為全球最大的基因組測(cè)序與分析中心，Illumina公司在測(cè)序領(lǐng)域的影響力由此可見(jiàn)一斑。
    在Sanger測(cè)序時(shí)代，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI）一直是該行業(yè)的龍頭老大，其壟斷地位無(wú)人能撼，從早期的377到全自動(dòng)化的3730xl，ABI的測(cè)序儀被廣泛應(yīng)用在基因組學(xué)研究的各個(gè)方面。然而在第二代測(cè)序技術(shù)迅猛發(fā)展之初，ABI起步較晚，顯得有些漫不經(jīng)心。直到2005年454公司推出GS平臺(tái)，ABI的領(lǐng)先地位受到威脅，這才開(kāi)始發(fā)力，迅速收購(gòu)了研發(fā)NGS的一家小公司Agencourt，并于2007年推出了它的SOLiD測(cè)序平臺(tái)。此后SOLiD不斷升級(jí)，目前已到SOLiD 5版本（SOLiD 5500xl）。SOLiD的全稱是Sequencing by Oligo Ligation Detection，即寡聚物連接檢測(cè)測(cè)序，其基本原理是通過(guò)熒光標(biāo)記的8堿基單鏈DNA探針與模板配對(duì)連接，發(fā)出不同的熒光信號(hào)，從而讀取目標(biāo)序列的堿基排列順序。在該方法下，目標(biāo)序列的所有堿基都被讀取了兩遍，因此SOLiD最大的優(yōu)勢(shì)就是它的高準(zhǔn)確率。據(jù)悉，SOLiD 5平臺(tái)的測(cè)序通量已達(dá)到30Gb/天，成本低于60美元/Gb，準(zhǔn)確率高達(dá)99.99%。并且由于SOLiD系統(tǒng)采用的不是PCR反應(yīng)進(jìn)行DNA合成與測(cè)序，因此對(duì)于高GC含量的樣本，SOLiD系統(tǒng)具有非常大的優(yōu)勢(shì)。
宣傳視頻：
454
沒(méi)找到
Solexa
http://www./Media/flash_player.ilmn?dirname=systems&swfname=GA_workflow_vid&width=780&height=485&iframe
SOLiD
http://media.invitrogen.com./ab/applications-technologies/solid/solid-5500.html
今天繼續(xù)，454測(cè)序詳解。
NGS之進(jìn)階篇
    454的焦磷酸測(cè)序原理，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是利用DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用，將PCR反應(yīng)每一個(gè)堿基（dNTP）的延伸與一次熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)記錄熒光信號(hào)的有無(wú)和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。在454測(cè)序儀中，A、T、G、C四種堿基是分別存儲(chǔ)在單獨(dú)的試劑瓶中的，每步反應(yīng)四種堿基依次加入反應(yīng)池，當(dāng)堿基配對(duì)結(jié)合，就會(huì)釋放出一個(gè)焦磷酸（PPi），而這個(gè)焦磷酸在酶的作用下，將熒光素氧化成氧化熒光素，并發(fā)出光信號(hào)，從而讀取出這一位置的堿基信息。
    454測(cè)序儀的整個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟可大致概括為：樣品處理、文庫(kù)制備、emPCR、反應(yīng)板準(zhǔn)備、上機(jī)測(cè)序。樣品處理主要是針對(duì)大片段的DNA分子，如基因組DNA、Fosmid或BAC質(zhì)粒等，利用超聲或氮?dú)獯驍鄬⑦@些DNA分子片段化，然后采用瓊脂糖凝膠電泳回收或磁珠純化，選擇500-800bp的DNA片段。對(duì)于非編碼RNA或PCR產(chǎn)物，則不需要這一步驟。文庫(kù)制備包括接頭連接和磁珠純化兩步，454的文庫(kù)接頭分A、B兩種，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的測(cè)序引物及4bp（TCAG）的“key”堿基構(gòu)成，其中B接頭的5’端帶有生物素（Biotin）標(biāo)記，用于磁珠純化步驟。經(jīng)過(guò)磁珠結(jié)合與DNA變性之后，只有A+目的片段+B形式的連接產(chǎn)物得以富集，另兩種形式（AA、BB）的產(chǎn)物都被去除。emPCR是454測(cè)序的一個(gè)關(guān)鍵步驟，將富集到的文庫(kù)與測(cè)序磁珠、各反應(yīng)物混合，加入特定的礦物油和表面活性劑，再利用振蕩器劇烈振蕩，使反應(yīng)體系形成油包水（water-in-oil）的穩(wěn)定乳濁液。在理想條件下，每一個(gè)液滴，或稱微反應(yīng)器（microreactor）中將只包含一個(gè)磁珠和一條單鏈DNA，通過(guò)控制該步驟的條件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方個(gè)理想的微反應(yīng)器。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，每一個(gè)磁珠上將形成密集的DNA簇，這些DNA序列完全相同，即可用于后續(xù)的步驟。454測(cè)序的反應(yīng)板稱為PTP（Pico Titer Plate），含有350萬(wàn)個(gè)由光纖組成的小孔，每個(gè)孔的直徑為29μm，而測(cè)序磁珠的直徑為20μm，因此每個(gè)孔中僅能容納一個(gè)磁珠。將磁珠與測(cè)序試劑加入PTP中，使之可用于上機(jī)測(cè)序。測(cè)序步驟如前所述，四種堿基在泵的控制下依次加入反應(yīng)板，反應(yīng)完成后再洗去，每延伸一個(gè)或若干個(gè)堿基，就會(huì)發(fā)出一次光信號(hào)，通過(guò)記錄信號(hào)的有無(wú)和強(qiáng)度，即可測(cè)定DNA序列。
    454測(cè)序準(zhǔn)確度較高，當(dāng)讀長(zhǎng)超過(guò)400bp時(shí)，其準(zhǔn)確性仍能達(dá)到99%以上，主要的錯(cuò)誤來(lái)自于同聚物，即相同堿基的連續(xù)延伸，如ATTTG這樣一段序列，A和G的讀取沒(méi)有問(wèn)題，但T只記錄了一次光信號(hào)，僅信號(hào)強(qiáng)度與ATG序列的T有所不同，因此同聚物越長(zhǎng)，可能產(chǎn)生的誤差就越大。目前，由于454測(cè)序儀在讀長(zhǎng)上的明顯優(yōu)勢(shì)，它在大基因組從頭測(cè)序（de novo）、轉(zhuǎn)錄組分析、基因組結(jié)構(gòu)分析等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。
   
    以下圖片：1. 454 GS FLX測(cè)序儀外觀；2. 3（4）種連接產(chǎn)物的磁珠純化；3. PTP板與測(cè)序磁珠；4. 454 GS測(cè)序峰圖；5. 上機(jī)準(zhǔn)備實(shí)拍圖。

NGS之進(jìn)階篇二：Solexa
    Illumina Solexa高通量測(cè)序平臺(tái)可以說(shuō)是目前“測(cè)序界”應(yīng)用最廣泛的NGS平臺(tái)，它在兼容性、操作性和成本方面有著較大的優(yōu)勢(shì)，第一個(gè)亞洲人基因組“炎黃一號(hào)”、第一個(gè)非洲人基因組、熊貓基因組、家蠶基因組甲基化圖譜等等，都是在該平臺(tái)的支持下完成的。從最初的GA到GA IIx，又更新?lián)Q代為現(xiàn)在的Hiseq2000，Solexa測(cè)序平臺(tái)的通量由1Gb/run一路提升至300Gb/run，預(yù)計(jì)在年內(nèi)還將實(shí)現(xiàn)1Tb/run的升級(jí)，測(cè)序讀長(zhǎng)也從幾十bp提高到150bp。當(dāng)年的人類基因組計(jì)劃用了10年時(shí)間完成了一個(gè)基因組的精細(xì)圖，而現(xiàn)在使用Hiseq2000測(cè)序儀只需10天左右的時(shí)間，即可完成至少3個(gè)人類全基因組的測(cè)序工作，NGS測(cè)序能力的飛速發(fā)展甚至超過(guò)了IT屆的摩爾定律。
    與454一樣，Solexa測(cè)序平臺(tái)所采用的也是SBS（Sequencing-by-Synthesis，邊合成邊測(cè)序）的方式，并且也利用光信號(hào)收集信息。有所不同的是，Solexa并沒(méi)有采用間接反應(yīng)（焦磷酸氧化熒光素）的形式激發(fā)光信號(hào)，而是直接在dNTP上連接熒光基團(tuán)和阻斷基團(tuán)，通過(guò)“去阻斷—延伸—激發(fā)熒光—切割熒光基團(tuán)—去阻斷”這樣一個(gè)循環(huán)的方法來(lái)依次讀取目的DNA上的堿基排列順序。如下圖所示，該原理在基礎(chǔ)篇的Solexa宣傳視頻中亦有提及。由于采用了可逆阻斷技術(shù)（即在dNTP上連接可剪切的阻斷基團(tuán)），Solexa測(cè)序的每一步只延伸一個(gè)堿基，不會(huì)出現(xiàn)類似于454測(cè)序的同聚物影響準(zhǔn)確性的問(wèn)題，因此其單堿基準(zhǔn)確性較高，但隨著讀長(zhǎng)的增加，熒光信號(hào)會(huì)有所衰弱，所以越“靠后”的堿基準(zhǔn)確性會(huì)逐漸降低，這也是Solexa測(cè)序讀長(zhǎng)受限的一個(gè)主要因素。

    Solexa平臺(tái)的應(yīng)用范圍極廣，幾乎囊括了目前基因組學(xué)研究的所有方面，例如基因組從頭測(cè)序（de novo）、重測(cè)序（re-sequencing）、基因組結(jié)構(gòu)分析、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、表達(dá)譜分析、小RNA及非編碼RNA測(cè)序、表觀遺傳學(xué)研究等等。然而，應(yīng)用該平臺(tái)的核心過(guò)程是大致相同的，這也為它的兼容性提供了很大的便利。Solexa測(cè)序的實(shí)驗(yàn)流程主要包括：樣品處理、文庫(kù)制備、芯片準(zhǔn)備及上級(jí)測(cè)序。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜆悠穪?lái)源的不同，Solexa測(cè)序的樣品處理也有所不同，基因組DNA需進(jìn)行打斷及片段選擇，total RNA需富集mRNA或小RNA，mRNA也要進(jìn)行片段化處理，ChIP（染色質(zhì)免疫共沉淀）、甲基化及PCR產(chǎn)物等都有各自的處理方式，需要實(shí)驗(yàn)人員根據(jù)情況進(jìn)行選擇。以基因組DNA測(cè)序?yàn)槔讷@得樣本后，首先需要對(duì)DNA進(jìn)行檢測(cè)，保證樣本的濃度和完整性符合實(shí)驗(yàn)要求，然后使用超聲或氮?dú)獯驍?，將這些DNA分子片段化，這步與454的樣品處理類似，但不需要收集特定范圍的DNA片段即可用于下一步實(shí)驗(yàn)。文庫(kù)制備過(guò)程可分為末端修復(fù)、3’端腺苷化、接頭連接、片段選擇、PCR擴(kuò)增以及文庫(kù)純化六個(gè)步驟。末端修復(fù)是將片段化的DNA分子在幾種酶的作用下，補(bǔ)齊隨機(jī)打斷造成的黏性末端而成為平末端。3’腺苷化目的是在DNA雙鏈的3’端加上dATP，以便于下一步的接頭連接。Solexa文庫(kù)制備所用的接頭（adapter）是一個(gè)一端互補(bǔ)，另一端開(kāi)叉Y字形DNA片段，互補(bǔ)的部分5’端有一個(gè)T，可與3’腺苷化的DNA進(jìn)行T-A連接，開(kāi)叉的部分則是為了通過(guò)PCR擴(kuò)增引入測(cè)序引物P5和P7的互補(bǔ)序列。接頭連接完成后，再采用采用瓊脂糖凝膠電泳回收或磁珠純化獲得特定大小的片段（通常為目的片段大小+120bp），如構(gòu)建200bp文庫(kù)，則回收320±20bp的DNA。之后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增和純化，即得到可用與上機(jī)測(cè)序的文庫(kù)。此時(shí)的文庫(kù)DNA由待測(cè)序列、測(cè)序接頭、引物互補(bǔ)序列及index標(biāo)簽序列（如非index文庫(kù)則無(wú)），如下圖所示。

    芯片準(zhǔn)備與上機(jī)測(cè)序主要由機(jī)器完成，在此不做贅述，若想做進(jìn)一步了解，可訪問(wèn)Illumina官方網(wǎng)站的技術(shù)支持：http://www./technology/sequencing_technology.ilmn。
    同樣，最后獻(xiàn)上幾張圖片：1. cBot芯片制備儀與Hiseq2000測(cè)序儀；2. Solexa GAII測(cè)序芯片；3. Solexa測(cè)序光信號(hào)采集直觀圖；4. Solexa測(cè)序流程與原理示意圖。