雌激素、胰島素樣生長因子Ⅰ對體外培養(yǎng)雞胚脛骨生長板軟骨細胞的影響

成為亨特 2013-10-19

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雌激素、胰島素樣生長因子-Ⅰ對體外培養(yǎng)雞胚脛骨生長板軟骨細胞的影響

【摘要】： 隨著組織工程學的不斷發(fā)展,對生長板軟骨細胞在體內(nèi)和體外的研究也越來越深入。國內(nèi)外大量的研究人員利用定量活體標記技術(shù)對哺乳類動物(包括人類)、嚙齒類動物、禽類及野生動物如蝙蝠等不同種屬動物的生長板生長、發(fā)育,病變發(fā)生、損傷修復機制和軟骨內(nèi)成骨過程等領(lǐng)域進行了廣泛而深入的研究。鑒于雞胚四肢骨骼是研究骨骼發(fā)育較為理想的模型之一,同時為了更深入研究生長板軟骨發(fā)育不良相關(guān)疾病,如肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良(tibial dyschondroplasia, TD),有必要對肉雞脛骨生長板軟骨細胞進行體外培養(yǎng)。通過對獲得的生長板軟骨細胞在體外的生長及發(fā)育特征以及對生長板軟骨的全身和局部調(diào)節(jié)因子如雌激素和胰島素樣生長因子-Ⅰ對其增殖和分化的影響的研究,為肉雞脛骨軟骨生長板軟骨發(fā)育不良等疾病的深入研究,以及人類和其它動物的軟骨體外修復,提供借鑒。試驗一、雞胚脛骨生長板軟骨細胞的體外培養(yǎng)及鑒定目的：建立雞胚脛骨生長板軟骨細胞的高效分離法,并對其進行鑒定。方法：設(shè)計以1 mg?mL-1的Ⅱ型膠原酶兩步消化法,分離制備脛骨生長板軟骨細胞,觀察其對12～20胚齡雞脛骨生長板軟骨細胞的分離效果；采用不同的染色方法,在倒置顯微鏡和光鏡下觀察體外培養(yǎng)條件下軟骨細胞的生物學特性。結(jié)果：(1)Ⅱ型膠原酶兩步消化可使生長板軟骨基質(zhì)完全解離降解,細胞均分離,細胞存活率達90%以上；(2)前兩代細胞貼壁生長呈圓形或多角形,單個鋪開時體積較大,生長匯合時呈卵圓形,Ⅱ型膠原免疫組化和甲苯胺藍(TB)異染反應均呈陽性；第4代以后細胞逐漸變?yōu)殚L梭形,Ⅱ型膠原免疫組化染色減弱,TB異染反應陰性；(3)前三代軟骨細胞長期培養(yǎng)下去,能逐漸匯合,并形成軟骨塊狀組織,堿性磷酸酶染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色強陽性,甲苯胺藍染色異染反應較強,茜素紅染色能觀察到鈣化結(jié)節(jié)。結(jié)論：采用兩步Ⅱ型膠原酶消化分離雞胚脛骨生長板軟骨細胞,具有細胞收獲率、細胞存活率高、操作簡便等特點；隨著傳代培養(yǎng)次數(shù)的增加,生長板軟骨細胞出現(xiàn)去分化,逐漸失去軟骨細胞的特異性表型；軟骨細胞若有合適附著基質(zhì),長期培養(yǎng)下去能保持較強的成骨能力。試驗二、雌激素對體外培養(yǎng)雞胚脛骨生長板軟骨細胞增殖分化的影響目的：在建立雞胚脛骨生長板軟骨細胞體外培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上,研究雌激素對雞胚脛骨生長板軟骨細胞增殖、分化和代謝功能的影響。方法：取生長狀態(tài)良好的第二代軟骨細胞接種于96孔板,添加不同濃度的雌激素,分別用MTT法、PNPP法測定軟骨細胞增殖率和軟骨細胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)活性,用全自動生化分析儀檢測細胞培養(yǎng)液中的鈣、磷、ALP含量。結(jié)果：(1)36 h,54 h,25～1600 pg?mL-1的雌激素均顯著促進了軟骨細胞的增殖(P0.01)。其中,作用54 h,200,400,800pg?mL-1的雌激素促增殖作用顯著；(2)54 h,400、800 pg?mL-1的雌激素顯著促進生長板軟骨細胞內(nèi)ALP活性(P0.01),1600 pg?mL-1的雌激素則顯著抑制軟骨細胞內(nèi)ALP活性(P0.01)；(3)細胞培養(yǎng)液中鈣濃度：在36 h,400、800 pg?mL-1雌激素作用下,明顯降低,18 h,400 pg?mL-1,明顯升高,54 h,隨雌激素的濃度增加而增加；磷濃度：400、800 pg?mL-1雌激素作用下,在各個時間段都處于較高的水平；ALP活性：在18 h,對照組和800 pg?mL-1含量較高,36 h,100、200、800 pg?mL-1明顯降低,54 h,隨濃度的增加,各組ALP呈下降趨勢。結(jié)論：雌激素能顯著促進軟骨細胞的增殖；使軟骨細胞內(nèi)的ALP顯著增加；但濃度越大,則呈現(xiàn)明顯的抑制作用；細胞培養(yǎng)液中鈣、磷隨培養(yǎng)時間延長而增高,ALP則隨時間增加而降低。試驗三、胰島素樣生長因子-Ⅰ對體外培養(yǎng)雞胚脛骨生長板軟骨細胞增殖分化的影響目的：在建立雞胚脛骨生長板軟骨細胞體外培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上,研究重組IGF-Ⅰ對雞胚脛骨生長板軟骨細胞增殖、分化和代謝功能的影響。方法：取生長狀態(tài)良好的第二代軟骨細胞于96孔板上進行重組IGF-Ⅰ作用下,用MTT法測定軟骨細胞增殖率,PNPP法測定軟骨細胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)活性,并用全自動生化分析儀測定體外培養(yǎng)軟骨細胞培養(yǎng)液中的鈣、磷及ALP含量。結(jié)果：(1)在36 h,10、15、20 ng?mL-1的IGF-Ⅰ使軟骨細胞增殖受到抑制(P0.01),隨作用時間的增加各種濃度作用下的軟骨細胞,均有增殖,但差異不顯著；(2)在36 h,10、20、40 ng?mL-1的IGF-Ⅰ可顯著促進軟骨細胞內(nèi)ALP活性(P0.01)。54 h,20、40 ng?mL-1的IGF-Ⅰ可顯著促進生長板軟骨細胞內(nèi)ALP活性(P0.01)；(3)軟骨細胞培養(yǎng)液中的鈣、磷隨IGF-Ⅰ濃度的增加而減少,隨培養(yǎng)時間延長,其濃度有所增加。在18 h,10 ng?mL-1的IGF-Ⅰ抑制了生長板軟骨培養(yǎng)液中ALP的活性,20、40 ng?mL-1的IGF-Ⅰ促進了軟骨細胞培養(yǎng)液中ALP的活性。隨培養(yǎng)時間的延長,ALP活性下降。結(jié)論：IGF-Ⅰ不能顯著促進軟骨細胞的增殖；但能顯著增加軟骨細胞內(nèi)ALP的活性；隨培養(yǎng)時間延長,細胞培養(yǎng)液中的鈣、磷有所增加,而ALP則下降。