PCR成為目前開展miRNA表達(dá)譜分析的最常用方法。它靈敏快速，操作簡(jiǎn)單。當(dāng)然，若想獲得穩(wěn)定可靠的結(jié)果，也須花費(fèi)一番努力。為此，Exiqon公司的專家分享了成功開展miRNA qPCR的五條重要建議，為大家的研究助力。

1. 選擇適當(dāng)數(shù)量的重復(fù)

使用重復(fù)的目的是消除差異引起的噪音。取決于樣品的差異程度，它可能需要包含生物學(xué)和技術(shù)重復(fù)。具體需要哪種重復(fù)，這取決于實(shí)驗(yàn)中引入最大變異的步驟。樣品本身需要生物學(xué)重復(fù)，而RNA提取、RT和PCR步驟需要技術(shù)重復(fù)。重復(fù)的數(shù)量取決于變異水平，但絕不能低于三個(gè)。如果只用了兩個(gè)重復(fù)，且它們差異顯著，那么就很難確定哪個(gè)是異常值。

2. 確定最佳的對(duì)照

在研究中應(yīng)當(dāng)使用陰性和陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照能用來(lái)顯示污染，并確定每個(gè)分析的背景水平。使用哪個(gè)陰性對(duì)照要取決于實(shí)驗(yàn)，但一般應(yīng)包括：

 無(wú)酶對(duì)照：不含酶的RT反應(yīng)，以檢查DNA污染
 無(wú)模板對(duì)照：不含模板的RT或PCR反應(yīng)，以檢查試劑是否存在污染，并顯示引物二聚體
 mock對(duì)照：帶有載體RNA（如MS2）的RT對(duì)照，以檢查提取過(guò)程中使用的載體或其他RNA是否會(huì)增加背景

實(shí)驗(yàn)中也應(yīng)當(dāng)使用陽(yáng)性對(duì)照，以檢查樣品的質(zhì)量，并進(jìn)行troubleshooting。陽(yáng)性對(duì)照可以是合成的RNA spike-in。這是cDNA合成反應(yīng)的對(duì)照，也很容易判斷樣品中是否存在PCR抑制劑。

3. 開展反應(yīng)的質(zhì)量控制

為了開展質(zhì)量控制，應(yīng)當(dāng)監(jiān)控?cái)U(kuò)增子的熔解溫度（Tm）和分析效率。miRCURY LNA? Universal RT microRNA PCR系統(tǒng)中使用SYBR Green檢測(cè)，這可以產(chǎn)生解離曲線，而不同運(yùn)行之間特定擴(kuò)增子的Tm應(yīng)當(dāng)相同。因此，Tm可用來(lái)驗(yàn)證是否獲得了相同的擴(kuò)增子。解離曲線應(yīng)當(dāng)只有一個(gè)峰，而不同儀器的Tm可能會(huì)有差異，這是因?yàn)椴煌臏囟刃?zhǔn)。

4. 選擇良好的參考基因

選擇最佳的參考基因或參考基因組合，這至關(guān)重要，它可實(shí)現(xiàn)miRNA定量分析的標(biāo)準(zhǔn)化。如果利用含有幾百個(gè)miRNA的分析板進(jìn)行篩選，標(biāo)準(zhǔn)化的最佳方法是取所有表達(dá)miRNA的平均值。在小型研究中，可使用一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)源對(duì)照。這可從篩選研究中選擇。如果未開展此類研究，則應(yīng)當(dāng)從文獻(xiàn)中挑出一些候選參考基因。

5. 選擇優(yōu)秀的數(shù)據(jù)分析軟件

適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)分析對(duì)您下結(jié)論很重要。利用高質(zhì)量的數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，如Exiqon GenEx，可獲得正確的miRNA圖譜。

在Exiqon GenEx中，一個(gè)易用的互動(dòng)助手將指導(dǎo)您導(dǎo)入數(shù)據(jù)，選擇適當(dāng)?shù)膮⒖蓟?，?biāo)準(zhǔn)化及最后的數(shù)據(jù)分析。

通過(guò)簡(jiǎn)單的幾步，Exiqon GenEx就能生成復(fù)雜的統(tǒng)計(jì)表以及可立即發(fā)表的圖片，讓您清晰地查看結(jié)果。

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