目前分離腎小球有以下方法:激光捕獲顯微切割腎小球、過篩法分離腎小球、磁珠合并過篩法分離腎小球。激光捕獲顯微切割腎小球法具有精確度高的優(yōu)點(diǎn),缺點(diǎn)是捕獲組織量相對較少,適用于對組織特異性要求較高、標(biāo)本珍貴且獲取較少組織即能達(dá)到解決問題的目的;過篩法分離腎小球具有短時間內(nèi)能捕獲大量活組織的優(yōu)點(diǎn),缺點(diǎn)是獲取的目的組織純度相對較差;磁珠合并過篩法分離腎小球既彌補(bǔ)了激光捕獲顯微切割捕獲腎小球量相對較少的缺點(diǎn)又能滿足獲取純度相對較高的腎小球的優(yōu)點(diǎn),但磁珠價格昂貴,故不作為常規(guī)方法。所以根據(jù)我們的目的,應(yīng)綜合考慮采取合適的分離方法以獲取腎小球。
下面主要來介紹一下最常用的過篩法分離大鼠腎小球的技術(shù)方法:
1、取腎皮質(zhì):10%水合氯醛0.3-0.5ml/100g,麻醉大鼠。無菌條件下用 4℃PBS沖凈腎臟組織表面血跡,剝離腎被膜,剪取腎皮質(zhì),將獲取的腎皮質(zhì)混在一起剪成1mm×1mm×1mm小塊。
2、篩網(wǎng)研磨:依次放入3層不銹鋼篩網(wǎng)??讖椒謩e為 172um,108um,75um。在最上層篩網(wǎng)上用消毒針筒輕碾腎皮質(zhì),同時用4℃PBS沖洗使其濾入下層篩網(wǎng)(108um)。用PBS沖洗這一道篩網(wǎng)(同時輕碾組織)。到75um 這層篩網(wǎng)時,盡量只沖洗不碾磨。
3、驗(yàn)證純度:在第 3層濾器上,用無菌的吸管吸取少量于培養(yǎng)皿中,顯微鏡下觀察,若見純凈腎小球達(dá)95%以上, 即可停止沖洗。
4、 收集小球:將培養(yǎng)皿中含腎小球的液體轉(zhuǎn)移到50ml離心管。
5、 離心:1200rpm 4℃ 3-5min,緩慢棄上清,沉淀即為腎小球。
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