花卉組培苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

1  范圍

本技術(shù)規(guī)程規(guī)定了河北省主要花卉組培苗生產(chǎn)環(huán)境的消毒滅菌、培養(yǎng)條件調(diào)控以及組培苗接種、繼代、生根、移栽等的技術(shù)操作程序，并對其生產(chǎn)、試驗設(shè)備、設(shè)施提出了具體要求。

本技術(shù)規(guī)程適用于河北省盆花和切花組培苗生產(chǎn)。

2  術(shù)語和定義

    下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

2.1  花卉

    凡是具有一定觀花、觀葉、觀芽、觀莖、觀果和觀根等觀賞價值，并經(jīng)過技術(shù)和藝術(shù)進(jìn)行栽培和養(yǎng)護(hù)的植物。

2.2  植物組織培養(yǎng)

    是指在無菌條件下，將離體的植物器官（如根、莖、葉、花、果實、種子等）、組織（如形成層、花藥組織、胚乳、皮層等）、細(xì)胞（體細(xì)胞和生殖細(xì)胞）以及原生質(zhì)體，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，使它們得以繼續(xù)生長、分化、形成完整植株的過程。

2.3  花卉組培苗

    以植物組織培養(yǎng)方法進(jìn)行繁殖的花卉苗木稱花卉組培苗。

2.4  植物生長物質(zhì)

    指一些調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的物質(zhì)。包括植物激素和植物生長調(diào)節(jié)劑。

2.5  外植體

    用于組織培養(yǎng)的組織、器官、細(xì)胞及原生質(zhì)體稱為外植體。

2.6  培養(yǎng)材料

    生長在培養(yǎng)容器內(nèi)培養(yǎng)基上的植物材料統(tǒng)稱培養(yǎng)材料。

2.7  培養(yǎng)基

    在植物組織培養(yǎng)過程中，由人工配制的提供培養(yǎng)材料生長所必需的營養(yǎng)元素和某些生理活性物質(zhì)的基質(zhì)。

2.8  接種

    將外植體經(jīng)消毒滅菌后，在無菌條件下放入培養(yǎng)容器內(nèi)培養(yǎng)基上的過程。

2.9  增殖

    指外植體或繼代組培苗產(chǎn)生出新的具有特定結(jié)構(gòu)和功能的組織或器官的現(xiàn)象。

2.10  繼代

    是指培養(yǎng)過程中將培養(yǎng)材料周期性地分株、分割、剪截等轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖的過程。

3  生產(chǎn)設(shè)備（施）及化學(xué)試劑

3.1   生產(chǎn)設(shè)備（施）

3.1.1 建筑設(shè)施

設(shè)計組培實驗室或小型組培工廠必須選擇環(huán)境優(yōu)靜、無污染的地方并保證其生產(chǎn)過程中不對周圍環(huán)境造成污染。實驗室或小型組培工廠各部分的配置要合理，做到工作方便、使用安全、節(jié)省能源。房屋設(shè)計包括準(zhǔn)備室、接種室、培養(yǎng)室、洗滌室、實驗室、貯存室、溫室，另外還可配置辦公室、更衣室等。

3.1.2  生產(chǎn)設(shè)備

3.1.2.1  洗滌設(shè)備

工廠化生產(chǎn)可選用自動或半自動洗瓶機(jī)，實驗室或小型車間選用普通洗滌用具，如洗滌室水槽、塑料盆、塑料桶、塑料箱等，人工洗滌。另外配置干燥箱、晾瓶架等。

3.1.2.2  滅菌設(shè)備

    高壓蒸汽滅菌鍋（大型臥式、中型立式、小型手提式））、器械消毒器、紫外燈、烘干箱、微濾孔器等。

3.1.2.3  接種設(shè)備及工具

    超凈工作臺、鑷子、剪刀、解剖刀、接種針、鋼絲架、酒精燈等。

3.1.2.4  培養(yǎng)設(shè)備

    培養(yǎng)容器（三角瓶、罐頭瓶、專制塑料瓶、試管等）、培養(yǎng)架、振蕩和旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)機(jī)、空調(diào)、光照培養(yǎng)箱等。

3.1.2.5  實驗設(shè)備

    冰箱、蒸餾水器、電子天平、架盤天平、pH 5.0～7.0精密試紙、酸度計、溫濕度表、照度計、盛裝器皿（燒杯、試劑瓶等）、計量器皿（量筒、容量瓶、移液管等）以及其他實驗室常用器具等。

3.1.2.6  細(xì)胞學(xué)觀察設(shè)備

    體視顯微鏡、解剖鏡、高倍顯微鏡，有條件的還可購置顯微照相設(shè)備、測微尺等。

3.2   常用化學(xué)試劑

3.2.1  洗滌劑

選用無污染洗衣粉、洗潔精、去污粉等。

3.2.2  滅菌劑

選用酒精、氯化汞、次氯酸鈉、高錳酸鉀、甲醛、過氧乙酸、新潔爾滅、來蘇水、抗菌素等。

3.2.3  無機(jī)鹽類和有機(jī)物類

    常用培養(yǎng)基如MS、B₅、N₆等大量元素和微量元素所規(guī)定的無機(jī)鹽類和有機(jī)物類；或者根據(jù)試管苗生產(chǎn)所用培養(yǎng)基種類購置所需化學(xué)試劑。常見培養(yǎng)基成分見附錄A。

3.2.4   植物生長物質(zhì)

細(xì)胞分裂素：6～芐基氨基嘌呤（6～BA）、激動素（KT）、玉米素（ZT）、2～異戊烯腺嘌呤（2ip）等。

細(xì)胞生長素：吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、2,4～二氯苯氧乙酸(2,4～D)等。

赤霉素：GA₃等。

乙烯：C₂H₄。

3.2.5  碳水化合物

    蔗糖或食用砂糖。

3.2.6  固化劑

可選用以下任何一種：組培專用培養(yǎng)基固化劑、微生物多糖固化劑、瓊脂等。

3.2.7  培養(yǎng)基附加成分

為促進(jìn)試管苗的生長，有時培養(yǎng)基中還可加入以下附加成分，氨基酸、水解乳蛋白（LH）300mg/L～500mg/L、水解酪蛋白（CH）200mg/L～500mg/L以及腺嘌呤(ADE)1mg/L～80mg/L等。

4  消毒滅菌操作規(guī)程

4.1  洗滌室的消毒滅菌

    每天用來蘇水、過氧乙酸等噴灑地面，保持室內(nèi)清潔。

4.2   接種室的消毒滅菌

    接種前用紫外燈照射20min～30min，并定期(一般7d)用高錳酸鉀及甲醛混合薰蒸。

4.3   培養(yǎng)室的消毒滅菌

    一般7d左右用高錳酸鉀及甲醛混合薰蒸，或用70％酒精噴霧消毒，也可選用廣普性殺菌煙霧劑薰蒸。

4.4  超凈工作臺的消毒滅菌

    接種前用紫外燈照射20min～30min，并用70％酒精噴灑臺面，或用新潔爾滅擦拭臺面；定期清洗超凈工作臺過濾膜以保證過濾膜清潔。

4.5  培養(yǎng)基的消毒滅菌

    高溫高壓蒸汽消毒，通常在壓力1.1kg/cm²、溫度121℃條件下保持15min～20min即可。

4.6  接種器具的消毒滅菌

    使用前進(jìn)行蒸氣消毒；接種過程中采用小型滅菌器或用酒精燈灼燒消毒。

4.7  污染的瓶苗消毒滅菌

用消毒鍋高溫高壓消毒，然后再清洗培養(yǎng)容器。

5  培養(yǎng)室環(huán)境調(diào)控

5.1  溫度

    培養(yǎng)室溫度應(yīng)控制在25℃±2℃；可根據(jù)培養(yǎng)物所需的最適溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)。

5.2  濕度

    培養(yǎng)室保持70％～80％的相對濕度。

5.3  光照

一般培養(yǎng)室光照強度控制在1500lx～3000lx，可根據(jù)培養(yǎng)物的需光特性調(diào)整光照強度；工廠化生產(chǎn)時，為降低成本可考慮利用自然光照。

6  組培苗生產(chǎn)操作規(guī)程

6.1  培養(yǎng)基的配制

6.1.1  培養(yǎng)基選擇

根據(jù)培養(yǎng)材料生長發(fā)育特性選擇合適的基本培養(yǎng)基種類和激素配比。（常見培養(yǎng)基見附錄A）。

6.1.2  母液的配制和保存

6.1.2.1  母液的配制

根據(jù)生產(chǎn)情況，母液可以配制成單一化合物母液，也可以配制成幾種化合物的混合母液。大量元素母液配制50倍，微量元素母液配制100倍，植物生長物質(zhì)配制濃度0.5mg/ml～1.0mg/ml，植物生長物質(zhì)的配制方法見附錄B。

6.1.2.2  母液的保存

母液配制好后，存放4℃的冰箱中。

6.1.3  培養(yǎng)基配制程序

6.2.1  培養(yǎng)材料的選擇和確定

可以選取生長健壯、無病蟲害、能保證原品種優(yōu)良性狀的植物體的任何部位，如莖尖、莖段、葉片等，還可根據(jù)需要，采用根、花瓣、鱗莖、花粉、花藥等部位來培養(yǎng)。

6.2.2  外植體的消毒滅菌

消毒液種類、濃度及消毒時間的長短需根據(jù)材料種類、部位及老、嫩程度確定，以達(dá)到最佳的消毒效果。可以根據(jù)材料部位選擇以下方法：

①莖尖、莖段及葉片等的消毒：70%酒精浸泡數(shù)秒鐘，無菌水沖洗2次～3次，再用0.5%～2%的次氯酸鈉浸泡10min～15min，用無菌水沖洗3次后接種；

②種子的消毒：70％酒精迅速漂洗一下，果實用2％的次氯酸鈉浸泡10min，無菌水沖洗2次～3次后接種果實內(nèi)的種子或組織；種子先用0.5％～2％的次氯酸鈉浸泡20min～30min或用0.1％的升汞消毒0.5min～5min，用無菌水沖洗3次后接種。

③根及地下部器官的消毒：0.1％～0.2％的升汞消毒5min～10min,或用2％的次氯酸鈉浸泡10min～15min,然后用無菌水沖洗3次～5次后接種。

6.3  初代培養(yǎng)

6.3.1  初代（誘導(dǎo)）培養(yǎng)基

    1/3MS + 6-BA0.2mg/L + IBA0.02mg/L為花卉組培苗常用初代培養(yǎng)基之一?？梢愿鶕?jù)培養(yǎng)的植物種類、接種部位具體調(diào)整。

6.3.2  外植體的接種

培養(yǎng)材料經(jīng)過消毒后，在無菌濾紙上切割成所需大小，然后進(jìn)行接種。

6.4  組培苗的增殖與繼代培養(yǎng)

培養(yǎng)材料的增殖類型最好采用側(cè)芽和叢生芽增殖類型。在培養(yǎng)基中添加植物生長物質(zhì)是組培苗增殖的主要手段，植物生長物質(zhì)的使用濃度和作用參見附錄B。組培苗的不斷增殖通過周期性的繼代培養(yǎng)來實現(xiàn)，繼代培養(yǎng)周期根據(jù)培養(yǎng)苗種類及生長情況而定，一般30d繼代1次，亦可根據(jù)需要20d～90d繼代1次。

6.5  組培苗生根

6.5.1　瓶內(nèi)生根

6.5.1.1　生根材料的選擇

    在繼代培養(yǎng)的組培苗中剪取或切取生長健壯、葉色正常、葉片舒展、適于生根的無根苗，接種在生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。

6.5.1.2  誘導(dǎo)生根

    采用生長素誘導(dǎo)組培苗生根，一般使用種類和濃度參見附錄B。極難生根的植物可采用二步生根法，第一步采用附加高濃度生長素的培養(yǎng)基誘導(dǎo)根原基的形成，第二步采用無激素的培養(yǎng)基誘導(dǎo)根的伸長。采用二步生根法時第一步通常黑暗培養(yǎng)，第二步需要光照培養(yǎng)。

6.5.2　瓶外生根

6.5.2.1　瓶內(nèi)誘導(dǎo)瓶外生根

    無根苗接種到生根培養(yǎng)基上，當(dāng)基部出現(xiàn)突起，即根原基形成后，直接煉苗移栽，使根的伸長在基質(zhì)中進(jìn)行。

6.5.2.2  瓶外生根（微扦插）

    把繼代培養(yǎng)的組培苗作為微型插條，用一定濃度的生長素如NAA、IBA或ABT生根粉（一般100ppm～800ppm）速蘸或浸泡，扦插到消毒后的無土基質(zhì)中，基質(zhì)多采用蛭石、草炭、珍珠巖或混合基質(zhì)等。注意溫度、濕度等環(huán)境條件，初期相對濕度要求高于90％，以后逐漸降低相對濕度在60％～80％之間。

6.6  組培苗煉苗移栽

6.6.1  組培苗煉苗

    組培苗在移栽前將培養(yǎng)瓶放置溫室自然散射光下，溫度控制在25℃±3℃，閉口煉苗7d左右，去掉瓶蓋再煉苗3d～5d，然后再移栽。

6.6.2  組培苗移栽

用鑷子將生根苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗去基部培養(yǎng)基，在800倍多菌靈溶液中浸泡30min后移栽到基質(zhì)中?；|(zhì)采用蛭石、草炭、珍珠巖或混合基質(zhì)等。控制溫度25℃±2℃，相對濕度前期80％～90％，以后逐漸降低濕度。當(dāng)試管苗根系發(fā)達(dá)、形成側(cè)須根以后，可以移栽到營養(yǎng)缽中，成為容器苗。

6.7  移栽苗管理

6.7.1  肥、水管理

組培苗移栽7d后開始噴施專用營養(yǎng)液，也可以噴施N～P～K比例為1∶1∶2的復(fù)合肥營養(yǎng)液，濃度一般不高于0.5‰，施肥濃度可隨著苗齡的增加適當(dāng)加大；基質(zhì)不宜太濕，以攥在手中指間不滴水為原則，噴水與施肥相結(jié)合。

6.7.2 病蟲害防治

a)  溫室使用前徹底消毒，用硫磺、百菌清煙霧劑熏蒸3～4次，溫室使用后經(jīng)常用福爾馬林、來蘇水消毒。

b)  加強通風(fēng)，每隔7d噴一次廣普性殺菌劑。

c)  一旦發(fā)現(xiàn)蟲害、病害及時藥物治療。

附錄A

（資料性附錄）

常用培養(yǎng)基成分表（單位：mg/L）

附錄B

（資料性附錄）

常用植物生長物質(zhì)（單位：mg/L）