3．人工化學(xué)合成DNA新形成的核苷酸鏈的合成方向是    3’ → 5’         ，合成的

DNA 5’末端是    -OH     ，3’ 末端是    -OH     。

4．一個(gè)理想的載體應(yīng)具備的條件是： 至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)  ，   有克隆位點(diǎn)       ，

具備轉(zhuǎn)化的功能       ，    遺傳標(biāo)記基因        ，  具有較高的載裝能力 。

5．進(jìn)行PCR擴(kuò)增DNA時(shí)，反應(yīng)體系應(yīng)加入模板DNA，   Taq 酶                ，

一對(duì)引物              ， dNTP   或   緩沖液   。

二、選擇題（每題2分，共計(jì)30分）

1．基因工程的單元操作順序是（  A  ）

Ａ．酶切，連接，轉(zhuǎn)化，篩選，驗(yàn)證    Ｂ．酶切，轉(zhuǎn)化，連接，篩選，驗(yàn)證

Ｃ．連接，轉(zhuǎn)化，篩選，驗(yàn)證，酶切    Ｄ．驗(yàn)證，酶切，連接，篩選，轉(zhuǎn)化

Ｅ．酶切，連接，篩選，轉(zhuǎn)化，驗(yàn)證

2．下列五個(gè) DNA 片段中含有回文結(jié)構(gòu)的是（   D、E  ）   
    Ａ．GAAACTGCTTTGAC                  Ｂ．GAAACTGGAAACTG
    Ｃ．GAAACTGGTCAAAG                  Ｄ．GAAACTGCAGTTTC
    Ｅ．GAAACTGCAGAAAG

3．T 4 -DNA 連接酶是通過(guò)形成磷酸二酯鍵將兩段 DNA 片段連接在一起，其底物的關(guān)鍵基團(tuán)是（  D  ）
   Ａ．2' -OH 和 5' -P                 Ｂ．2' -OH 和 3' -P
   Ｃ．3' -OH 和 2' -P                 Ｄ．3' -OH 和 5' -P
   Ｅ．5' -OH 和 3' -P

4．l-DNA 體外包裝的上下限是天然l-DNA 長(zhǎng)度的（ D  ）
   Ａ．25 - 50 %                       Ｂ．50 - 100 %
   Ｃ．75 - 100 %                      Ｄ．75 - 105 %
   Ｅ．100 - 125 %

5．下列各常用載體的裝載量排列順序，正確的是（ A  ）
   Ａ．Cosmid > l-DNA > Plasmid   Ｂ．l-DNA > Cosmid > Plasmid
   Ｃ．Plasmid > l-DNA > Cosmid   Ｄ．Cosmid > Plasmid > l-DNA
   Ｅ．l-DNA > Plasmid > Cosmid

6．某一重組質(zhì)粒 （7.5 kb）的載體部分有2個(gè)SmaI酶切位點(diǎn)。用SmaI酶切后凝膠電泳上出現(xiàn)4條長(zhǎng)度不同的條帶，其長(zhǎng)度總和與已知數(shù)據(jù)吻合，該重組質(zhì)粒中插入的外源DNA片段上的SmaI酶切位點(diǎn)共有（  D   ）
   Ａ．5 個(gè)                        Ｂ．4 個(gè)
   Ｃ．3 個(gè)                        Ｄ．2 個(gè)         Ｅ．至少 2 個(gè)

7．若某質(zhì)粒帶有 lacZ 標(biāo)記基因，那么與之相匹配的篩選方法是在篩選培養(yǎng)基中加入(   D、E  )                            
   Ａ．半乳糖             Ｂ．葡萄糖                Ｃ．蔗糖
   Ｄ．5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷（X-gal）
   Ｅ．異丙基巰基-b-半乳糖苷（IPTG）

8．分子雜交的化學(xué)原理是形成（ E  ）
   Ａ．共價(jià)鍵                      Ｂ．離子鍵
   Ｃ．疏水鍵                      Ｄ．配位鍵          Ｅ．氫鍵

9．促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素（ EPO ）基因能在大腸桿菌中表達(dá)，但卻不能用大腸桿菌的基因工程菌生產(chǎn)人的促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素，這是因?yàn)椋?nbsp; E  ） 
    Ａ．人的促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)大腸桿菌有毒性作用
    Ｂ．人的促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素基因在大腸桿菌中極不穩(wěn)定
    Ｃ．大腸桿菌內(nèi)毒素與人的促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素特異性結(jié)合并使其滅活
    Ｄ．人的促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)大腸桿菌蛋白水解酶極為敏感
    Ｅ．大腸桿菌不能使人的促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素糖基化

10．鳥(niǎo)槍法克隆目的基因的戰(zhàn)略適用于（   A   ）
    Ａ．原核細(xì)菌                   Ｂ．酵母菌
    Ｃ．絲狀真菌                   Ｄ．植物           Ｅ．人類(lèi)

11．cDNA第一鏈合成所需的引物是（ D ）
    Ａ．Poly A                     Ｂ．Poly C 
    Ｃ．Poly G                     Ｄ．Poly T         Ｅ．發(fā)夾結(jié)構(gòu)

12．cDNA法獲得目的基因的優(yōu)點(diǎn)是（   B  ）
    Ａ．成功率高                   Ｂ．不含內(nèi)含子
    Ｃ．操作簡(jiǎn)便                   Ｄ．表達(dá)產(chǎn)物可以分泌     Ｅ．能糾正密碼子的偏愛(ài)性

13．人工合成 DNA 的單元操作包括（   E    ）
I 去保護(hù)  II 偶聯(lián)  III 封端  IV 氧化 
    Ａ．I + II                     Ｂ．II + IV
    Ｃ．I + II + III               Ｄ．II + III + IV        Ｅ．I + II + III + IV

14．為了減輕工程菌的代謝負(fù)荷，提高外源基因的表達(dá)水平，可以采取的措施有（ A、C ）

A．將宿主細(xì)胞生長(zhǎng)和外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段。

B．在宿主細(xì)胞快速生長(zhǎng)的同時(shí)誘導(dǎo)基因表達(dá)。

C．當(dāng)宿主細(xì)胞快速生長(zhǎng)時(shí)抑制重組質(zhì)粒的復(fù)制。

D．當(dāng)宿主細(xì)胞快速生長(zhǎng)時(shí)誘導(dǎo)重組質(zhì)粒的復(fù)制

15．菌體生長(zhǎng)所需能量（ A  ）菌體有氧代謝所能提供的能量時(shí)，菌體往往會(huì)產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物乙酸。

A．大于                        B．等于

C．小于

三、問(wèn)答題（共計(jì)50分）

1．基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的兩種主要表現(xiàn)形式是什么？基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性

的主要機(jī)制是什么？（10分）

基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式：

1．結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性：重組 DNA 分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生

物學(xué)功能的喪失

2．分配不穩(wěn)定性：整個(gè)重組 DNA 分子從受體細(xì)胞中逃逸。

基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的的產(chǎn)生機(jī)制

1．受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對(duì)外源重組 DNA 分子的降解

2．外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常的生長(zhǎng)代謝

3．重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)的不均勻分配，這是重組質(zhì)粒逃逸的基本原因

4．受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組分子的缺失重排

2．在人胰島素AB鏈分別表達(dá)法中，為何將AB鏈編碼序列與b-半乳糖苷酶基因融合？（10分）

小分子蛋白在大腸桿菌中表達(dá)后不穩(wěn)定，容易被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶降解失活。表達(dá)融合蛋白的優(yōu)點(diǎn)是基因操作簡(jiǎn)便；在菌體內(nèi)比較穩(wěn)定，不易被細(xì)菌酶類(lèi)所降解，容易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。人胰島素AB鏈分別表達(dá)法中，將A、B鏈編碼序列與b-半乳糖苷酶基因融合，分別表達(dá)出融合蛋白，使表達(dá)的蛋白分子量足夠大，避免被蛋白水解酶分解，提高其穩(wěn)定性及表達(dá)率。

3．動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法有哪些？各自的特點(diǎn)是什么？（10分）

1．懸浮培養(yǎng)

懸浮培養(yǎng)即讓細(xì)胞自由地懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)增殖。它適用于一切種類(lèi)的非貼壁依賴(lài)性細(xì)胞（懸浮細(xì)胞），也適用于兼性貼壁細(xì)胞。該培養(yǎng)方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)條件比較均一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，在培養(yǎng)設(shè)備的設(shè)計(jì)和實(shí)際操作中可借鑒許多有關(guān)細(xì)菌發(fā)酵的經(jīng)驗(yàn)。不足之處是由于細(xì)胞體積較小，較難采用灌流培養(yǎng)（perfusion culture )，因此細(xì)胞密度一般較低。

2．貼壁培養(yǎng)

貼壁培養(yǎng)是必須讓細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)方法。它適用于一切貼附依賴(lài)性細(xì)胞（貼壁細(xì)胞），也適用于兼性貼壁細(xì)胞。該方法的優(yōu)缺點(diǎn)與懸浮培養(yǎng)正好相反，優(yōu)點(diǎn)是適用的細(xì)胞種類(lèi)廣（因?yàn)樯a(chǎn)中所使用的細(xì)胞絕大多數(shù)是貼壁細(xì)胞），較容易采用灌流培養(yǎng)的方式使細(xì)胞達(dá)到高密度；不足之處是操作比較麻煩，需要合適的貼附材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧較差。

3．貼壁—懸浮培養(yǎng)

微載體培養(yǎng)既可創(chuàng)造相當(dāng)大的貼附面積供細(xì)胞貼附生長(zhǎng)增殖，滿(mǎn)足了絕大多數(shù)細(xì)胞的基本要求，又由于載體的體積很小，比重較輕，在輕度攪拌下即可攜帶細(xì)胞自由地懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)，充分發(fā)揮了懸浮培養(yǎng)的一切優(yōu)點(diǎn)。

4. 闡述基因工程藥物研制有那些主要過(guò)程（10分）

基因工程藥物的生產(chǎn)必須首先獲得目的基因，然后用限制性?xún)?nèi)切酶和連接酶將所需目的基因插入適當(dāng)?shù)妮d體質(zhì)粒或噬菌體中并轉(zhuǎn)入大腸桿菌或其他宿主菌（細(xì)胞），以便大量復(fù)制目的基因。對(duì)目的基因要進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶和核苷酸序列分析。

目的基因獲得后，最重要的就是使目的基因表達(dá)?；虻谋磉_(dá)系統(tǒng)有原核生物系統(tǒng)和真核生物化的難易。將目的基因與表達(dá)載體重組，轉(zhuǎn)入合適表達(dá)系統(tǒng)，獲得穩(wěn)定高效表達(dá)的基因工程菌（細(xì)胞）。

建立適于目的基因高效表達(dá)的發(fā)酵工藝，以便獲得較高產(chǎn)量的目的基因表達(dá)產(chǎn)物。

建立起一系列相應(yīng)的分離純化、質(zhì)量控制、產(chǎn)品保存等技術(shù)。     

5．闡述鼠源性單克隆抗體改造后的小分子抗體類(lèi)型（10分）

（1）人－鼠嵌合抗體

將鼠MAb的可變區(qū)和人抗體的恒定區(qū)組成嵌合抗體由于這兩部分在空間結(jié)構(gòu)上相對(duì)獨(dú)

立，其獨(dú)特的抗體親和力保持得很好，但因鼠單抗可變區(qū)的存在，應(yīng)用時(shí)仍有較強(qiáng)的排斥反應(yīng)。

（2）改形抗體

在嵌合抗體的基礎(chǔ)上進(jìn)一步將鼠MAb可變區(qū)中相對(duì)保守的FR替換成人的FR，保留與抗原結(jié)合的CDR部位

（3）Fab抗體

Fab段由重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與整個(gè)輕鏈以二硫鍵形式連接而成，主要發(fā)揮抗體的抗原結(jié)合功能。Fab抗體只有完整IgG的1/3。

（4）單鏈抗體

單鏈抗體(Single chain Fv，scFv)是由一段彈性連接肽(Linker)把抗體可變區(qū)重鏈(VH)與輕鏈(VL)相連而成，是具有親代抗體全部抗原結(jié)合特異性的最小功能結(jié)構(gòu)單位。

（5）單域抗體

只含V區(qū)基因片段的小分子抗體，即只有VH或 VL一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，也能保持原單克隆抗體的特異性。這種小分子的抗體片段就稱(chēng)為單域或單區(qū)抗體，其分子量?jī)H為整個(gè)Ig分子的1／12。

（6）分子識(shí)別單位

只含有一個(gè)CDR多肽的抗體。