王亞楠^1，2，孔曉瑜¹，史成銀²

(1．中國海洋大學水產學院，山東 青島 266003；

 2．中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東 青島 266071)

摘要：魚類抗病毒非特異性免疫系統(tǒng)主要包括自然殺傷細胞、單核巨噬細胞系統(tǒng)及干擾素，蛋白因子白介素、趨化因子、腫瘤壞死因子及干擾素誘導產生的蛋白激酶PKR、Mx蛋白、主要組織相容性蛋白、一氧化氮合成酶在魚類抗病毒免疫中發(fā)揮重要的作用。了解病毒與魚體之間的相互作用機理，為魚類病毒性疾病防控奠定基礎。

關鍵詞：魚類；抗病毒；非特異性免疫

魚類病毒病是嚴重影響水產養(yǎng)殖業(yè)的世界性難題。經典的免疫學理論將機體的抗病毒免疫分為兩部分，即特異性免疫及非特異性免疫。在進化過程中，魚類處于連接高等脊椎動物和低等無脊椎動物的特殊地位。其特異性免疫機制不完善，非特異性免疫占重要地位，免疫易受水溫的影響。

遇到病原后，首先并迅速起防衛(wèi)作用的是非特異性免疫應答。在魚類體內執(zhí)行非特異性免疫應答的有吞噬細胞、自然殺傷細胞及血液和體液中存在的抗菌分子，它們在魚類防止感染中扮演重要角色。對于病毒而言，具有重要意義的非特異性免疫細胞有兩類，一類是自然殺傷細胞(NK)，另一類是單核巨噬細胞系統(tǒng)。與此同時，某些非特異性的體液因子也發(fā)揮了重要作用，其中最具代表意義的是干擾素(IFN)。

1 自然殺傷細胞

    自然殺傷細胞(NK細胞)是一類由骨髓干細胞分化而來的非特異殺傷細胞。表型特點是表達其表面特有的抗原標記CD56和CD16。從細胞特性來說，NK細胞既參與非特異性免疫應答，也通過與特異性T淋巴細胞在殺傷功能上的互補作用參與特異性免疫應答。在病毒感染中，NK 細胞通過多糖及脂多糖分子直接殺傷被病毒感染的組織細胞；同時，還能夠以另一種與其他受體交聯(lián)識別的方式殺傷病毒感染的細胞。大多數(shù)病毒感染細胞后主動下調宿主細胞表面MHCⅠ類分子的表達，從而避開MHCⅠ類分子限制的細胞毒性殺傷作用(CTL)對感染細胞的殺傷，而NK細胞所表達的殺傷抑制受體(killer inhibitory receptor，KIR)與CD16及多糖蛋白受體的交聯(lián)，可識別那些由于病毒感染而下調了MHCⅠ類分子表達的細胞。另外，NK細胞表面具有白介素2(IL-2)和白介素12(IL-12)受體，在病毒侵入機體形成最初炎癥時，可以被炎性因子及趨化因子誘導產生的IL-2直接激活而成為抗病毒感染的前鋒。同時，NK 細胞在激活后還可分泌γ干擾素(IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF)。

1．1 白介素

    白介素(Interleukin，IL)是與魚類致炎作用以及調理功能密切相關的一個功能性蛋白家族。白介素家族的典型成員包括了IL-1，IL-2，IL-6等，其中IL-1包括IL-1α，IL-1β1和IL-1β2都屬于三葉草型細胞因子家族的成員。在魚的體內，白介素樣分子參與并且在免疫反應中發(fā)揮重要作用。已經報道在鯉魚(Cyprinus carpio)、斑點叉尾鲴(Ictalurus punctatus)和大西洋鮭(Salmo salar)體內存在IL-1樣分子。Pelegry P等用RT-PCR方法分離克隆了烏頰海鯛(Aparus macrocephalus)的IL-1β基因。Engelsma M Y等檢測了鯉魚腦、垂體、頭腎、脾臟中的IL-1βmRNA 的表達。Kono T等用DNA注射方法研究鯉魚對于IL-1β的免疫反應。Bird S 等用RT-PCR 方法在小點貓鯊(Scyliorhinus canicula)的脾臟和睪丸中發(fā)現(xiàn)有IL-1β基因的表達，并且證明其和虹鱒IL-1β有31.7%的相同氨基酸組成。董偉仁等利用比較基因組學方法，在河豚(Fugu rubripes)基因組中鑒定了IL-2基因。邱麗華等采用同源克隆和末端快速擴增(RACE)的方法，從經LPS刺激的花鱸(Lateolabrax japonicus)總RNA反轉錄產物中獲得了803 bp的IL-8 cDNA序列。

1．2 趨化因子

趨化因子包括了約4O種小分子分泌型細胞因子，根據(jù)氨基酸序列中頭兩個半胱氨酸殘基的總數(shù)目進行分類，可分為CXC、CC、C和CX3C等幾種。在魚類中，已見報道的有CXC和CC家族的成員，趨化因子受體基因也有報道發(fā)現(xiàn)。首先報道的魚類趨化因子屬于CXC型，它是由一種元頜魚七鰓鰻(Lam petra fluviatilis)編碼的類L8多肽，Liu L等克隆了虹鱒(Oncorhynchus mykiss)體內的趨化因子家族的CC基因。Kuroda N等鑒定了硬骨魚類趨化因子家族的7個新成員。與在哺乳動物體內一樣，魚類體內的趨化因子在中性粒細胞和巨噬細胞的遷移過程中可以作為潛在化學引誘物存在。其激活一般要和有7個跨膜區(qū)域的G蛋白偶聯(lián)受體結合共調節(jié)。

1．3 腫瘤壞死因子-α

腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是魚類體內存在的腫瘤壞死因子的主要成員。TNF-α是β-Jellyroll家族的成員，在細胞膜內以Ⅱ型跨膜蛋白或糖蛋白的形式存在，蛋白質C端區(qū)域通過剪切釋放具有生物學活性的功能肽。近年來，采用同源克隆和EST等分子生物學手段，已從虹鱒、金頭鯛(Sparus aurata)、斑馬魚(Danio rerio)、鯉魚、真鯛(Pagrus major)等多個養(yǎng)殖品種中克隆到TNF-α基因。魚體在脂多糖(LPS)和刀豆蛋白A(ConA)等刺激劑刺激下產生的細胞因子可以和哺乳動物TNF-α進行交叉反應，并且具有激活巨噬細胞的生物學功能。Hirono I等研究認為，牙鲆(Paralychthys olivaceus)TNF-α的cDNA序列為TNF-α家族的典型序列。虹鱒體內有140 bp的5’UTR，506 bp的3’UTR，739 bp的

開放閱讀框(ORF)，試驗證明，在牙鲆的外周血白細胞和腎臟中都有TNF-α的表達。

2 單核巨噬細胞系統(tǒng)

單核巨噬系統(tǒng)在各組織部位的細胞，作為一類重要的集吞噬與抗原遞呈作用為一體的細胞，在聯(lián)系非特異性抗病毒反應與特異性抗病毒免疫反應中更具有重要意義。它們可以吞噬被病毒感染的細胞及被病毒破壞的細胞碎片，經酶水解等過程，將病毒抗原分子降解成為小分子肽段，并通過其自身表達的MHC Ⅱ類分子遞呈于細胞表面，從而激活特異性T淋巴細胞和B淋巴細胞反應，將抗病毒免疫由非特異性反應引入特異性反應。它同時可以利用其吞噬功能，通過表面的多糖受體和Fc受體，非特異的清除組織中的病毒顆粒及病毒感染細胞。Neurnannl N F等在鯽(Carassius auratus)頭腎細胞培養(yǎng)物中分離出形態(tài)、細胞化學和殺菌機制不同的三類巨噬細胞。魚類的巨噬細胞不僅具有殺傷細菌及寄生蟲的作用，而且能夠在受到微生物侵擾時被微生物的有害產物激活。另外，與哺乳動物類似，魚類巨噬細胞執(zhí)行免疫功能和細胞因子多層次多方面進行相互協(xié)同的調節(jié)。

3 干擾素

IFN系統(tǒng)是脊椎動物抵抗病毒入侵的第一道屏障，能在病毒感染后幾小時內迅速起作用，而特異性抗體要在幾天或幾周之后才能由淋巴細胞產生。根據(jù)來源、序列、活性等方面的區(qū)別，干擾素最初分為兩族，Ⅰ型干擾素和Ⅱ型干素。Ⅰ型干擾素主要包括人體內發(fā)現(xiàn)的α、β、ω、κ，以及在反芻動物中發(fā)現(xiàn)的τ和在小鼠中發(fā)現(xiàn)的ζ等幾個亞族。Ⅱ型干擾素只有一種γ干擾素。近年發(fā)現(xiàn)的λ干擾素(IFN-λ)被認為是新的一族干擾素。

Gravell等首次發(fā)現(xiàn)傳染性胰腺壞死病毒(IPNV)在23℃ 能誘導黑頭軟頭鰷的鰭傳代細胞FHM分泌一種類似哺乳類IFN的抗病毒活性物質。此后又在多種病毒感染的魚類和魚類培養(yǎng)細胞中得到證實，如虹鱒、舌齒鱸(Dicentrarchus labrax)、大麻哈魚(0．keta)、鯉魚、草魚(Ctenopharyngodon idellus)、金魚(Carassius aurattus Li．)、鯽魚、牙鲆等，并發(fā)現(xiàn)魚類IFN至少有兩類：第一類為耐酸(pH 2穩(wěn)定)、耐熱。由病毒或dsRNA等誘導，性質與哺乳類I型IFN相似。如病毒性溶血敗血癥病毒(VHSV)和PolyI：C誘導的鮭類IFN都有酸穩(wěn)定性；第二類為不耐酸、不耐熱。由白細胞、T細胞或巨噬細胞產生，由絲分裂素等誘導，與哺乳類Ⅱ型IFN相似。早在1967年，Sigel就指出，魚類IFN可能是魚類特異性免疫反應不足的一種補充，水溫較低魚體免疫低下時，它的合成在抵抗病毒感染中能發(fā)揮重要作用。

3．1 干擾素誘導產生的蛋白分子

由干擾素誘導的，形成細胞及機體抗病毒狀態(tài)的反應產物，均是細胞內具有一定功能的蛋白分子，它們各自在細胞特定生物學狀態(tài)下執(zhí)行相應的生理功能，但當它們在病毒即將感染的細胞內形成一個系統(tǒng)時，各自的生物學功能通過整合相加，從而形成一個具有較大威力的抗病毒狀態(tài)。這些蛋白分子中，蛋白激酶PKR、Mx蛋白、主要組織相容性抗原、一氧化氮合成酶(NOS)在魚類中已有研究。

3．1．1 蛋白激酶  蛋白激酶(PKR)是一類可由干擾素誘導產生、RNA依賴的絲氨酸蛋白激酶。在干擾素處理的細胞中，PKR主要出現(xiàn)于細胞質內，并與核糖體相連，細胞核內也可見到小量的PKR存在。PKR作為抗病毒因子的基本機理，是其對病毒mRNA翻譯環(huán)節(jié)的抑制。通常直接激活PKR的是雙鏈形式的RNA，它使PKR 自動發(fā)生磷酸化?；罨蟮?span lang=EN-US>PKR至少可使6個蛋白質分子內的磷酸化過程被催化。胡成鈺等根據(jù)鯽魚類PKR蛋白激酶基因(CaPKR-like)的全長cDNA序列，克隆CaPKR-like Zα結構域cDNA，表明CaPKR-like蛋白在病毒感染的細胞中很可能也能結合dsRNA，并形成二聚體，行使類似哺乳類PKR的各種生理功能。

3．1．2 GTPase的活性的Mx蛋白  干擾素誘導產生的細胞蛋白中，對包括MxA和Mx1的Mx蛋白家族認識比較充分。動物試驗和細胞水平上的分析，都已充分肯定了Mx蛋白對病毒增殖過程的有效阻滯，它的特點是不需要其他干擾素誘導成分的輔助，自身就可以表現(xiàn)抗病毒活性。這個蛋白事實上是屬于類動力蛋白GTPase的超家族成員，而且此酶的活性本身就是抗病毒活性所需。

利用Poly I：C及病毒在虹鱒、大西洋鮭、牙鲆以及魚類細胞系RTG22、CHSE2214等都能成功誘導Mx蛋白或Mx、mRNA的表達。虹鱒的3個Mx基因、大西洋鮭3個Mx基因以及牙鲆Mx和cDNA都已經成功克隆。所有魚類Mx都具有脊椎Mx蛋白的結構特征，包含一個三聯(lián)體GTP結合區(qū)域，在MX蛋白的C端有高度保守的Leu拉鏈。向虹鱒肌肉注射包含編碼病毒VHSV糖蛋白基因的質粒進行DNA免疫，除了能產生很強的激素應答反應外，還能激活機體特異性或非特異性的抗病毒機制，其中Mx和mRNA強烈表達。天然野天村病毒感染鯰魚可以顯著的上調Mx和mRNA在所有組織中的表達。進一步研究表明，DNA免疫虹蹲，在早期可能是誘導魚體非特異性的抗病毒機制，由Ⅰ型IFN介導初步保護；較長期的保護則是誘導產生對免疫基因(如病毒糖蛋白基因)特異性的抗病毒反應。同樣，所有經編碼病毒糖蛋白基因免疫的虹鱒均能從腎和肝檢測到高濃度的Mx蛋白，表明Mx蛋白的表達與魚體的抗病毒機制有一定的相關性。

3．1．3 主要組織相容性抗原  主要組織相容性抗原是非特異性免疫系統(tǒng)中極其復雜和最具多態(tài)性的一類分子?？煞譃榻Y構上和功能上都不同的Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類(Ⅲ類為補體系統(tǒng)的成分)。其中Ⅰ類和Ⅱ類抗原分子均是表達在細胞表面的穿膜型糖蛋白，各由兩條不同的多肽鏈借非共價鍵組成異二聚體結構，其共性是具有抗原多肽結合區(qū)。魚類主要組織相容性抗原包括MHCⅠ類分子和MHCⅡ類分子。近年來已從鯉、大西洋鮭、斑馬魚、虹鱒等多種魚類中克隆MHCⅠ類分子和Ⅱ類分子基因，二者具有獨立的免疫學應答。魚類MHC分子的成功分離和純化，證明與其他物種(如哺乳動物)MHC分子具有高度的同源性，并顯示其與免疫球蛋白(Ig)超家族可變族高度相似。

3．1．4 誘導型一氧化氮合成酶  干擾素誘導的一氧化氮合成酶(NOS)是一類催化依賴于NADPH氧化L-精氨酸產生一氧化氮和胍氨酸的酶，它包括同屬一個家族的3個同工酶，即NOS，神經細胞NOS和內皮細胞NOS。NOS可以增加一氧化氮的產生，后者可以激活巨噬細胞的功能，使其在天然免疫和獲得性免疫反應中發(fā)揮作用。Saeij J P等用鰷魚的NOS寡核苷酸序列作為引物，擴增出了鯽的NOS cDNA文庫，序列數(shù)據(jù)中有57%和人的NOS相同。用鮭魚菌(Renibacterium salmoninarumv)經注射或浸泡方法處理虹鱒后，在其鰓和頭腎中均發(fā)現(xiàn)有NOS的表達，在魚類中已經確認巨噬細胞釋放的細胞因子可以調節(jié)NOS的活性，還證明在魚類體內存在的NOS激活機制和哺乳動物的類似。

    近40年來的研究認為，魚類存在IFN系統(tǒng)的證據(jù)，主要來自對病毒誘導的培養(yǎng)細胞上清液進行檢測時，發(fā)現(xiàn)的具有類似哺乳類IFN的抗病毒活性物質，但是，直到今天，也沒有成功純化出任何一種魚類IFN蛋白。

3．2 干擾素誘導的抗病毒機制

IFN誘導的抗病毒機制主要有3條途徑，即PKR(依賴dsRNA 的蛋白激酶途徑)、2-5A合成酶途徑和Mx蛋白質途徑。PKR是一類由病毒雙鏈RNA激活的激酶，能磷酸化真核起始因子2(eIF2)，最后導致對病毒和細胞蛋白合成的抑制。2-5A合成酶被病毒雙鏈RNA激活后，將ATP轉化為2’，5’-環(huán)狀寡聚腺苷酸，后者激活核酸酶L(RNase L)，降解病毒和細胞mRNA。Mx蛋白屬于動力蛋白家族的GTP酶，據(jù)推測其通過抑制病毒核衣殼在細胞內的轉移而抑制病毒的復制。

最近魚類IFN系統(tǒng)基因的鑒定和克隆取得了重大進展，不僅有IFN基因，而且還包括參與IFN信號通路、表達調控及IFN誘導的具有抗病毒功能的ISG。在IFN誘導細胞抗病毒狀態(tài)之前加入微量ActD，可使IFN的抗病毒作用消失，表明魚類IFN對病毒的抑制作用是通過對細胞內轉錄和轉譯水平的調控來完成的，依賴于細胞內RNA和蛋白質的合成。在同種細胞上，魚類IFN具有廣譜抗病毒活性，對魚類和非魚類病毒、RNA 和DNA 病毒都有抑制作用。

4 結語

在病毒感染早期，除病毒抗原誘發(fā)的少量抗體的中和作用外，非特異性免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要作用，隨著病毒感染程度的深入，細胞免疫不斷強化才能清除病毒。病毒致病可能通過dsRNA和PKR的激活抑制宿主蛋白表達，也與復制過程中mRNA引物的使用導致宿主mRNA降解有關。在病毒與宿主細胞相互作用制約的感染過程中，病毒能夠利用其特殊的病毒編碼產物干擾和頡頏宿主免疫反應，使病毒能長期生存。在控制病毒性疾病過程中病毒疫苗發(fā)揮重要作用，盡管在病毒疫苗研制領域中，還有各種技術問題需要進一步的探索，但是近年所面臨的是對病毒與宿主細胞及機體之間的關系知之甚少。因此，加強對病毒與細胞、機體的相互關系的研究，是提升防治病毒性疾病整體技術能力的基礎。

（參考文獻）

（信息來源：《動物醫(yī)學進展》2008.5）